3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

ществляют с использованием длительного круглосуточного нахождения животных в замкнутом пространстве камер, содержащих в окружающем воздухе пары этанола в выбранной концентрации (определяется схемой эксперимента) от нескольких суток до 8 недель. В течение всего эксперимента внутри камер животные имеют постоянный свободный доступ к сухому брикетированному корму и поилкам с водой. Санацию камер с заменой воды и корма осуществляют 1 раз в сутки в течение 45-ти мин; за указанное время, если это соответствует выбранной схеме эксперимента, животным могут быть введены изучаемые вещества или растворитель в изомерных объемах или взяты пробы для определения уровней концентрации этанола в крови.

Камеры представляют из себя герметичные контейнеры, выполненные из любых нетоксичных материалов, не вступающих в химическое взаимодействие с этанолом с размерами 30×50×70 см, объем которых позволяет в условиях данного эксперимента одновременно содержать в каждой из них не более 10 крыс или не более 20 мышей). Камеры должны быть оборудованы внутренними вентиляторами для равномерного перемешивания газовой смеси и постоянной приточно-вытяжной вентиляцией из атмосферного воздуха с учетом физиологических особенностей функции дыхания животных (частота дыхания в норме 110–180 дых/мин (крысы); 130–200 дых/мин (мыши) [13] при достаточном содержании в камерах кислорода (скорость постоянного воздухообмена в камерах составляет 2 л/мин). Насыщение камер парами алкоголя выбранной концентрации осуществляется из резервуара, содержащего этанол, с помощью регулируемой капельницы, через которую этанол поступает в испаритель (90 °С), а затем в камеры. Постоянный уровень концентрации этанола в камерах рассчитывается с учетом дозированной скорости поступления в них этанола и скорости в них воздухообмена (2л/мин) по формуле:

Y = C , V ×X

где Y — необходимое количество поступления этанола (мл/мин) для поддержания постоянной (требуемой) концентрации этанола в камере; Х — заданная скорость (л/мин) прохождения атмосферного воздуха через камеру (с помощью приточно-вытяжной вентиляции); V — объем камеры (л); С — требуемая постоянная концентрация паров этанола в камере (мл/л).

Впроцессе эксперимента инструментальный контроль уровня концентрации паров этанола в атмосфере, окружающей с животных, может быть осуществлен с помощью дробного отбора из камеры проб воздушной смеси необходимого объема для оценки данного показателя с помощью газового хроматографа. Общая схема эксперимента в зависимости от поставленной задачи может варьировать.

Вкачестве варианта данной методики используют непостоянную алкоголизацию животных, при которой периоды содержания в парах этанола («интоксикация») чередуются с периодами («детоксикации») алкогольной абстиненции (12–17ч/7–12 ч) в течение длительного времени, что способствует ускоренному развитию поведенческих изменений, характерных для алкогольной зависимости. Например, в популяции беспородных крыс увеличение «самовведения» алкоголя наблюдается уже через 2 недели хронического прерывистого содержания в парах этанолах [21], в то время как в условиях постоянной ингаляции аналогичное увеличение потребления алкоголя достигается спустя 4–6 недель [22]. Несомненным преимуществом хронической прерывистой алкоголизации животных в парах этанола являются облегчение тестирования острой абстиненции и возможность проведения индивидуального мониторинга динамики развития алкогольной зависимости, так как животные могут быть протестированы во время ежедневных периодов лишения этанола (по достижению концентрации алкоголя в крови равной нулю) и затем возвращены в камеры с парами этанола для последующей алкоголизации.

321

Таблица 3 Показатели содержания алкоголя в крови и соответствующие изменения поведения

у крыс при содержании животных в парах этанола, которые могут быть визуально зарегистрированы

Примечание: большинство поведенческих характеристик идентично для восходящего («интоксикация») и нисходящего («детоксикация») участков кривой концентрации алкоголя в крови, за исключением поведения, связанного с низким содержанием алкоголя. Как только уровень алкоголя снижается («детоксикация») до нуля, появляются симптомы синдрома отмены.

По Gilpin №.W. et al., 2008 [23].

В этих условиях (см. пункты 3.2.1., 3.2.2.) оценка эффекта изучаемых веществ осуществляется по динамике нарастания проявлений состояния абстиненции (как критерия уровня развития физической зависимости, пункт 4) после отмены процедуры хронического вдыхания паров этанола у животных контрольной группы, которые могут быть сопоставлены с результатами указанных показателей у животных, которым по выбранной схеме вводили изучаемые вещества ежедневно в процессе алкоголизации.

При данной схеме эксперимента изучаемые вещества вводят за выбранный экспериментатором интервал времени непосредственно перед регистрацией показателей уровня абстинентных проявлений последовательно в период через 24, 48 и 72 ч после отмены хронического вдыхания ими паров этанола.

Интерпретация полученных результатов. Ослабление уровня алкогольной абстиненции указывает на то, что изучаемое вещество в условиях сформированной физической зависимости от этанола способно ослаблять патологические процессы, обусловленные хроническим действием алкоголя. Срок экспозиции животных в парах этанола должен быть определен экспериментально по достижению у них выраженных проявлений абстиненции (пункты 4.1–4.3.). Иными словами, ослабление скорости нарастания проявлений алкогольной абстиненции в данном тесте свидетельствует о том, что изучаемое вещество препятствует формированию физической зависимости от этанола.

Спектр влияния изучаемых веществ на патологические проявления алкогольной абстиненции на тех же животных (пункты 4.1–4.3.) может быть существенно расширен за счет привлечения «батареи» тестов для оценки состояния функции разных систем при отмене этанола (на уровне ЦНС, вегетативной нервной системы, ССС и т.д.), острых эффектов этанола (пункты 1.1–1.7.), уровня толерантности к эффектам этанола (пункт 6.). Проведение такого рода исследований позволит уточнить возможный

322

спектр влияния искомых веществ на процесс формирования физической зависимости от этанола и ее проявлений в условиях абстиненции, что позволит сформулировать перспективу возможных показаний к их дальнейшему применению.

2.4. Проявления алкогольной абстиненции

Показатели уровня абстинентных проявлений у животных регистрируются после отмены хронического вдыхания ими паров этанола (или иного способа алкоголизации) используя следующие тесты:

2.4.1.Судороги, вызванные «хендлингом»

Исследования проводят на беспородных мышах. Через 2, 4, 6, 8 ч после отмены продолжительного потребления этанола (добровольное потребление в условиях свободного выбора или потребление в условиях ограниченного доступа или содержания в парах этанола) оценивают поведение мышей на наличие судорожных реакций. Каждую мышь поднимают за хвост вертикально и в этом положении вращают на 180 °С. Регистрируют степень выраженности судорог согласно балльной шкале (таблица 4). Изучаемое вещество (исследуемая группа животных), или растворитель в изомерном объеме (контрольная группа) вводят за 2 ч до отмены этанола. Количество животных в каждой группе должно быть не менее 10–12 особей.

Интерпретация полученных результатов:

Уменьшение выраженности судорожных реакций при отмене этанола под действием изучаемого вещества свидетельствует о его способности ослаблять проявления алкогольного абстинентного синдрома.

Таблица 4

По Besheer J. et al., 2009 [24] адаптировано.

При выборе животных для конкретного эксперимента следует учитывать, что, например, мыши линии C57BL/6 относительно устойчивы к индуцированным отменой этанола судорогам, в то время как мыши линии DBA/2J, наоборот, демонстрируют к ним повышенную чувствительность.

2.4.2. Аудиогенные судороги, индуцированные отменой этанола

Эксперименты проводят на крысах. Животным, помещенным в звукоизоляционные камеры, предъявляют звуковой сигнал (интенсивность 50 дБ, частота 10 кГц, продолжительность 90 с) и регистрируют следующие показатели: латентный период возник-

323

новения и длительность двигательного возбуждения, а также интенсивность судорожных реакций, которую оценивают в баллах: 0 — отсутствие реакции; 1 балл — сильное двигательное возбуждение, безудержный бег, прыжки; 2 балла — клонические судороги в позе «на брюшке», развивающиеся вслед за двигательным возбуждением; 3 балла — двигательное возбуждение, сопровождающееся клоническими судорогами в боковом положении; 4 балла — предыдущие фазы заканчиваются тоническими судорогами [25]. Изучаемые вещества вводят до предъявления звукового раздражителя. Сопоставляют результаты влияния изучаемых веществ на судорожные проявления, полученные у контрольных (не имевших контакта с этанолом) животных, с аналогичными реакциями у животных в период отмены этанола.

Интерпретация полученных результатов. Ослабление судорожных реакций под влиянием изучаемых веществ у животных после отмены этанола указывает на их положительный противосудорожный компонент в отношении токсических эффектов алкоголя.

Таблица 5 Сравнительная эффективность различных противосудорожных средств

на моделях судорожных реакций, вызванных отменой этанола

По Rogawski М., 2005 [26], адаптировано.

2.4.3. Оценка реакции «вздрагивания» при предъявлении звукового сигнала

Указанная процедура позволяет сопоставить влияние изучаемых вешеств на характер поведенческой реактивности животных к внешней звуковой стимуляции на фоне хронического потребления этанола, с уровнем их реактивности в период алкогольной абстиненции.

Эксперименты проводят на крысах и/или мышах, используя инструментальную оценку реакции вздрагивания. Установка состоит из платформы, оснащенной датчиками давления, расположенной в звукоизоляционной камере со слабым освещением (10 лк). После 5-минутной адаптации к экспериментальным условиям животные подвергаются

324

звуковой экспозиции (120 дБ, 240 Гц, продолжительность 50 мсек, количество исследований не менее 10 с произвольным интервалом в 10–20 с). Регистрируют латентный период реакции и величину ответа при предъявлении звукового сигнала. Реакция вздрагивания может оцениваться через 4–72 ч после отмены хронического потребления этанола [27, 28].

В упрощенном виде проводят визуальную оценку поведения мышей в условиях алкогольной абстиненции, которым последовательно предъявляют 5 громких звуковых сигналов с интервалом 16–20 с в момент, когда животное всеми лапами стоит на полу. Параметры звукового воздействия: частота 100 Гц, интенсивность 110 дБ, длительность звукового импульса 0,2 с, время нарастания импульса 0,05 с. Реакцию животных оценивают в баллах: 0 — видимое отсутствие реакции; 1 — замирание; 2 — вздрагивание; 3 — прыжок [12].

Изучаемые вещества вводят в соответствии с позициями, освещенными в пункте 3.2.

Интерпретация полученных результатов. Ослабление под влиянием изучаемых веществ последствий отмены этанола в поведении животных, оцениваемых по реакции «вздрагивания», может рассматриваться в качестве позитивной коррекции состояния повышенной возбудимости как одного из проявлений алкогольной абстиненции.

2.5. Восстановление алкогольной мотивации после лишения доступа к этанолу

Методическиеподходы,позволяющиеизучатьпроцессвосстановления(reinstatement) алкогольной мотивации, направлены на экспериментальное моделирование «срыва» ремиссии у больных алкоголизмом, то есть на восстановление потребления этанола после его депривации.

Для экспериментов используют животных (чаще всего крыс), предварительно подвергшихся хронической алкоголизации и в последующем перенесших различный по времени абстинентный период. В настоящее время для изучения рецидивов алкогольного поведения чаще всего используют алкоголь-депривационную модель и модели восстановления потребления алкоголя (reinstatement models).

2.5.1.Добровольное потребление алкоголя

вусловиях алкоголь-депривационного эффекта

Алкоголь-депривационный эффект (АДЭ) — реакция животных на повторное предоставление свободного доступа к алкоголю в период абстиненции в виде временного увеличения его потребления по сравнению с предшествуюшим алкогольной депривации периодом.

Модель позволяет количественно оценить уровень добровольного потребления алкоголя после разных сроков лишения животных контакта с этанолом: на этапе формирования алкогольной мотивации (см. пункт 2.1–2.2.), на этапе развития физической зависимости от этанола в условиях свободного выбора между этанолом и водой (пункт 3.1.) или после ускоренного формирования алкогольной зависимости при пассивном содержании животных в парах этанола (пункт 3.2.). С учетом сказанного время предварительной алкоголизации может варьировать от нескольких дней до 8 месяцев и более; период депривации: от 24 ч до 28 дней.

В период депривации продолжительностью около 3-х суток животных, находящихся в индивидуальных ячейках, снабженных мерными поилками с раствором этанола и водой, лишают доступа к раствору этанола. Через заданный временной интервал в соответствии с выбранной схемой (через 24, 48 или 72 ч после отмены этанола) животным вновь предоставляют раствор этанола. После чего оценку индивидуального потребления жидкостей осуществляют в тех же условиях, что и оценку добровольного потребления алкоголя в условиях свободного выбора между раствором этанола и водой. Количество жидкостей в поилках после предоставления этанола измеряют: через 1,5 ч после начала

325

индивидуального теста; через 24 ч после начала индивидуального теста; при тесте продолжительностью более суток — каждые последующие 24 ч. Подсчитывают потребление спирта и воды, выражающееся в г/кг в час. Оценивают амплитуду АДЭ в виде разницы между темпом потребления алкоголя в первые 1,5 ч после депривации и таковыми до депривации, а также скорость восстановления потребления алкоголя до уровня, имевшегося перед лишением алкоголя [12].

Изучаемые вещества вводят животным до их тестирования, исходя из предварительно выбранных экспериментатором сроков и способов их использования, в зависимости от известных или предполагаемых свойств взятых на исследование веществ.

В качестве препаратов сравнения для снижения потребления алкоголя в условиях алкоголь-индуцированного восстановления потребления у крыс могут быть использованы налоксон (0,1–10,0 мг/кг)[29] и акампросат (200,0–400,0 мг/кг) [30].

Интерпретация полученных результатов. Предполагается, что АДЭ может рассматриваться как модель рецидива алкоголизма, главным образом потому, что увеличение алкогольной мотивации при абстиненции согласуется с данными КИ о провоцирующем эффекте к повторной алкоголизации даже небольших количеств алкоголя у людей. В этом отношении алкоголь-депривационная модель имеет достаточную прогностическую значимость [31]. Уровень возможного позитивного «противоалкогольного» эффекта у изучаемых веществ оценивают по характеру уменьшения количества добровольно потребляемого раствора этанола в рассматриваемых условиях у получающих ЛС группы животных по сравнению с контрольными животными.

2.5.2.Восстановление потребления этанола

вусловиях оперантного поведения

Данная методика позиционируется как экспериментальное моделирование у контактирующих с алкоголем животных ситуаций, провоцирующих людей на возобновление потребления алкоголя в условиях ремиссии (запах этанола, его однократная небольшая доза, влияние средовых факторов, стрессовая ситуация) [32].

Методика включает три последовательных этапа:

а) предварительное обучение с использованием пищевой (и/или питьевой) мотивации оперантному поведению — стабильному получению этанола при надавливании животным на педаль;

б) подавление (угасание) условно-рефлекторной реакции на этанол с помощью замещения этанол-содержащих растворов на растворитель или прекращением подачи алкоголя;

в) тестирование уровня алкогольной мотивации в условиях фазы угасания с использованием условно-рефлекторных сигналов, провоцирующих возобновление добровольное потребление алкоголя.

Крыс в начале эксперимента размещают индивидуально в контролируемом по температуре и влажности помещении в условиях 12ч/12 ч суточного цикла (день/ночь). Обучение навыкам оперантного поведения проводят 6 дней в неделю в период с 10:00–14:00. Животные имеют свободный доступ к воде и стандартному корму в домашних клетках за исключением периода обучения нажатию на педаль.

Эксперименты проводят в стандартных камерах для изучения оперантного поведения размером 30,5×24,2×29,2 см. Каждая камера оснащена педалью и контейнером, заполненным гранулированным кормом или раствором этанола.

Обучение крыс нажатию на педаль начинают после пищевой депривации (24 ч). Крысы начинают нажимать на педаль, получая каждый раз по 45 мг гранулированного корма во время 10–20 мин сеанса, направленного на формирование навыка. Обучение проводят дважды в день в течение 4-х дней. После того как животные приобретут навык оперантного поведения, гранулированный корм заменяют на 20% раствор сахарозы (1 сеанс продолжительностью 20 мин) для перехода животных к иному положительному стимулу.

326

На следующий день крысы получают 5% этанол, смешанный с 0,1% раствором сахарина. За 30 сек до начала сеанса крыс помещают в оперантную камеру без освещения, в которой нажатие на педаль не приводит к каким-либо последствиям. С началом сеанса включают свет, и крысы имеют возможность получать положительное подкрепление в течение 20 мин. При нажатии на педаль животные получают возможность получать однократно по 0,1 мл жидкости. При предоставлении этанола сеанс сопровождается характерным звуковым сигналом (щелчок) и световой вспышкой над контейнером с жидкостью в течение 4 с. Непосредственно перед помещением животных в камеру 6 капель экстракта эфирно-масличного растения (например, мяты или апельсина) распыляют внутри камеры в качестве дифференцирующего стимула, указывающего на присутствие этанола. На протяжении последующих 2-х недель концентрацию этанола постепенно увеличивают так, что в последнем 20-минутном сеансе крысы получают 10% этанол с 0,1% раствором сахарина. Для последующих экспериментов берут животных, потребляющих как минимум 0,5 г/кг алкоголя в пересчете на чистый этанол.

Стимулы, способствующие ускоренному восстановлению самовведения алкоголя.

Использование этанола в качестве условного стимула.

Через 4–8 дней (фаза затухания) этанол в дозе 0,48 г/кг (в/б и интрагастрально) восстанавливает потребление алкоголя у крыс. Эффект провоцирующей дозы этанола умеренный и во многом определяется сопутствующими стимулами, ассоциирующимися с алкоголем [33].

Использование факторов окружающей среды в качестве условных стимулов.

Обучение животных нажатию на педаль для получения алкоголя или воды сопровождается подачей характерного звукового (например, 70 дБ), визуального (например, световая вспышка в течение 5,0 с) или/и обонятельного (например, запах 5–6 капель 10% этанола или экстракта апельсина) сигнала. Во время фазы затухания условнорефлекторной реакции нажатие на педаль не сопровождается определенными стимулами и предоставлением этанола или воды. Восстановлению алкогольной мотивации способствует предъявление преимущественно обонятельных стимулов [34].

Использование стресса в качестве условного стимула.

Вкачестве стрессирующего фактора используют переменные удары током (5 или 15 мин). В отличие от провоцирующей дозы этанола, данная стрессовая ситуация значительно восстанавливает самовведение алкоголя у крыс, не влияя на параметры потребления сахарозы в аналогичных условиях [35].

Взависимости от конкретной задачи исследования изучаемые вещества вводят до или после применения указанных стимулов перед тестированием характера ускоренного восстановления самовведения этанола.

2.5.3. Изучение влияния фармакологических веществ на «угасание» этанол-индуцированного подкрепления

Крысы (n=12) получают раствор этанола, как описано выше, в течение 4-х недель. Эти условия обусловливают комплекс стимулов (обонятельных, зрительных и звуковых), специфически сопряженных с потреблением этанола. Животных делят на 2 группы (n=6) в соответствие с потреблением этанола за последние 7 дней. Через 4 недели после формирования условной реакции животных лишают каких-либо стимулов и подкрепления при нажатии на педаль («фаза угасания») в течение 5 дней, во время которых за 10 мин до помещения в камеру одна группа животных получает инъекцию растворителя (контроль), а другая — изучаемого вещества. После окончания сеансов «угасания» в течение последующих 4-х дней изучают влияние условных стимулов на восстановление потребления этанола в отсутствии изучаемого вещества (или растворителя). Все сеансы восстановления потребления начинают с предоставления соответствующего обонятельного стимула, помещенного в камеру за 10 мин до тестирования. Во время тестирования в камере сохраняется стандартное освещение, и каждое нажатие на педаль сопровождается звуковым и зрительным стимулом.

327

В качестве препарата сравнения, препятствующего восстановлению потребления этанола, используют налтрексон [36, 37].

Интерпретация полученных результатов. Замедление скорости восстановления объемов добровольного потребления животными этанола в условиях оперантного поведения можно рассматривать как проявление возможной «противоалкогольной» активности у изучаемых веществ. В случае получения позитивных результатов при введении этих веществ до предъявления условной стимуляции можно предполагать наличие протективных свойств у данных препаратов. При введении изучаемых веществ после окончания воздействия указанных стимулов последующее ослабление самовведения этанола следует расценивать как купирование этими веществами последствий стимулов, ускоряющих восстановление его «потребления». Следует отметить, что такие выводы можно сделать при условии, если рассматриваемые вещества per se в аналогичных условиях у контрольных животных, но без применения соответствующих стимулов, не оказывают влияния на реакцию добровольного восстановления самовведения этанола.

3.Дополнительные методы

3.1.Развитие толерантности к действию этанола

Оценка влияния фармакологических веществ на уровень толерантности к алкоголю осуществляется через 24, 48 и 72 ч после отмены этанола по окончании процессов формирования алкогольной мотивации, а также по окончании формирования физической зависимости от этанола. Указанная оценка в зависимости от поставленной задачи может быть проведена с использованием тестов для изучения острых эффектов этанола по характеру продолжительности алкогольного наркоза, показателям его фармакокинетики, с помощью поведенческих тестов по изучению уровня алкогольной интоксикации, а также с применением стандартных методов инструментальной оценки артериального давления, ЭКГ, частоты дыхательных движений у животных.

3.2.Электрофизиологическая регистрация структуры сна

вусловиях длительной алкоголизации и в период алкогольной абстиненции

Электрофизиологическая оценка структуры сна на различных этапах алкоголиза-

ции животных, а также динамика изменений циклов сна отражают начальные и последующие стадии экспериментального алкоголизма вплоть до развития физической зависимости [38].

В исследовании используют крыс с устойчиво сформировавшейся алкогольной мотивацией вследствие добровольной (не менее 6 месяцев потребления 15% раствора этанола) или принудительной (содержание в парах этанола) алкоголизации. Животных оперируют под нембуталовым наркозом, вживляя им хронические электроды в гиппокамп с координатами (Р 4,9; L 3,5; H 3,0) [39] и в дорсальную группу шейной мускулатуры для последующей непрерывной 4-х часовой электрофизиологической регистрации структуры сна. Через неделю после операции и 3-х дневной адаптации к экспериментальным условиям регистрируют картину сна с учетом основных параметров: 1) общее время сна (ОВС), мин; 2) время фазы медленного сна (ФМС), мин; 3) время фазы быстрого сна (ФБС), мин; 4) число эпизодов ФБС; 5) среднюю длительность эпизодов ФБС, мин; 6) латентный период ФБС, мин; 7) среднее время сна без пробуждений за ОВС, мин (глубина сна); 8) общее время бодрствования, мин; 9) число пробуждений; 10) среднюю продолжительность пробуждений, мин; 11) латентный период первого цикла «ФМСФБС», мин (процесс засыпания).

Анализ структуры сна проводят на фоне потребления, а также во время лишения доступа к этанолу. Изучаемые соединения вводят до начала регистрации перечисленных показателей структуры сна.

328

В этих условиях этанол per se в дозе 2,25 г/кг нарушает структуру сна как при однократном, так и при многократном его введении, вызывая следующие изменения:

—сокращение ОВС;

—уменьшение отдельных эпизодов ФБС;

—удлинение латентного периода ФБС;

—увеличение времени бодрствования.

При абстиненции после добровольной алкоголизации на протяжении 8 месяцев и более возникают резкие расстройства сна, которые проявляются в наибольшей степени в 1-й и 7-й дни после отмены этанола. Сокращаются ОВС, ФМС, ФБС, число эпизодов ФБС.

Рассматриваемый метод может быть применен для оценки влияния изучаемых веществ на электрофизиологическую структуру сна в условиях изучения острых эффектов этанола (см. пункты 1.5–1.7.), на этапе формирования алкогольной мотивации (пункты 2.1.; 2.2.), в условиях сформированной физической зависимости от этанола (см. пункты 3.1.; 3.2;) и при алкогольной абстиненции.

Интерпретация полученных результатов. Ослабление перечисленных выше параметров нарушенного этанолом сна в указанных условиях в виде увеличения представленности ФМС и ФБС, сокращения длительности пробуждений и сокращения времени бодрствования под действием изучаемых соединений может свидетельствовать об эффективности этих веществ в плане нормализации структуры сна, нарушаемой в процессе острой или хронической, насильственной или добровольной алкоголизации животных.

4.Биохимические методы

4.1.Влияние фармакологических веществ на фармакокинетику этанола

Показатели фармакокинетики этанола косвенно отражают процессы, связанные с

его всасыванием с места поступления, распределением в тканях, скоростью его деградации, выведением его составляющих в виде неизмененного продукта и его метаболитов из организма. При изучении влияния фармакологических веществ на фармакокинетику этанола следует иметь в виду, что их эффект можно рассматривать как воздействие на общие механизмы деградации алкоголя с участием перечисленных процессов.

4.1.1. Метод газовой хроматографии

Кровь, взятая из хвостовой вены крыс или мышей (6 μl) и стандарты (6 μl; от 0 до 300 мг/100 мл) смешивают с 375 μl дистиллированной воды и 0,5 г NaCl в 12×75 мм пробирках из боросиликатного стекла. Закрытые пробирки нагревают при температуре 55 °С в течение 10 мин на водяной бане, затем из них пластиковым шприцом извлекают 1,5 мл газовой фазы и сразу вводят в газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором, оснащенным внешним адаптером и 1,0 мл внешней загрузочной петлей. Скорость потока водорода, газа-носителя и внутреннего генератора воздушного потока составляет 13,3, 25 и 250 мл/мин соответственно. Максимальное время удерживания 2 мин. Площадь под кривой рассчитывают при помощи стандартных программ (например, SRI Peak Simple software для Windows) [40].

4.1.2. Спектрофотометрический метод

Образцы крови (40 микролитров), взятой из хвостовой вены, смешивают с 3% перхлорной кислотой (конечный объем 200 микролитров) и хранят при 4 °С до определения содержания алкоголя с помощью ферментативного анализа. Образцы (20 микролитров) инкубируют в 1 мл 0,5 М Tris HCl буффере (pH 8,8), содержащем 5,5 микрограммов/мл алкогольдегидрогеназы и 1,5 мМ β-NAD в течение 40 мин при комнатной температуре. Содержание алкоголя в образце определяют по количеству β-NAD, измеряемому спектрофотометрически при длине волны 340 нм. Концентрацию алкоголя в крови определяют с помощью стандартной калибровочной кривой (0–500 мг %).

329

4.2. Влияние изучаемых веществ на вызываемые этанолом изменения активности

этанол-окисляющих ферментов при алкогольной интоксикации

Предметом изучения становится уровень активности конкретных ключевых ферментов, определяющих метаболизм этанола, а именно АДГ и АЛДГ.

4.2.1. Влияние изучаемых веществ на активность этанол-метаболизирующего фермента цитохрома Р450 2Е1,

выделенного из печени животных (ex vivo)

Хроническое потребление этанола приводит к увеличению содержания CYP2E1 апопротеина и мРНК.

4.2.1.1. Приготовление фракций печени S10

Животных подвергают эвтаназии путем смещения шейных позвонков. Извлекают печень и гомогенизируют в 50 м МTris-HCl буфере (pH 7,5), содержащем 0,25 М сахарозы, 25 м М KCl и 3 м М MgCl2. Гомогенаты центрифугируют при 2000 × g в течение 10 мин при 4 оС. Осадок, содержащий клеточные ядра, отбрасывают и супернатант центрифугируют при 10 000 × g в течение 10 мин при 4 оС. Осадок, содержащий митохондрии, отбрасывают и собирают супернатант (S10 фракция). Концентрацию белка во фракции S10 определяют по методу Бредфорда [41]. Известное количество белка немедленно обрабатывается для определения активности фермента CYP2E1.

4.2.1.2.Ферментный анализ цитохрома Р450 2Е1 Анализ ферментативной активности цитохрома Р450 2Е1 проводят на фракциях пе-

чени S10 (n=6–11 для каждой группы) согласно описанию Chang et al. (1998) [42]. Известное количество белка из контрольной и подвергнутой алкоголизации печеночной фракции S10 инкубируют с 100 μМ p-нитрофенола в присутствии NADPH-образующей системы при 37 °С на водяной бане. В конце инкубации ферментативную реакцию останавливают путем добавления трихлоруксусной кислоты и образцы центрифугируют при 10 000 × g в течение 5 мин. К известному объему супернатанта добавляют 2 М NaCl и регистрируют активность спектрофотометрически при длине волны 535 нм. Гидроксилирование p-нитрофенола (субстрат) до p-нитрокатехола (продукт) в определяемых образцах рассчитывают в соответствии с калибровочной кривой для p-нитрофенола (0,1– 20 нмоль), которую анализируют одновременно с неизвестными образцами. Активность фермента CYP 2E1 выражается в виде нмоль продукта/мин/г S10 белка.

4.3.Определение активности алкогольдегидрогеназы (АДГ) и альдегид дегидрогеназы (АЛДГ) в печени (ex vivo)

Гомогенаты печени готовят в фосфатно-сахарозном буфере, содержащем 1% Тритон Х-100 и 1 нМ меркаптоэтанол, и центрифугируют при 10 000 × g в течение 30 мин. Для определения активности АДГ и АЛДГ супернатанты анализируют по образованию NADH спектрофотометрически при длине волны 340 нм. АДГ активность измеряется при pH 8,5 в пирофосфатно-глициновом буфере с 50 мМ этанола и 1 мМ 4-метилпиразолом в референтной кювете. АЛДГ определяют при pH 8,8 в присутствии 0,5 мМ 4-метилпиразола и 1мМ меркаптоэтанола, используя 0,5 мМ ацетальдегид в качестве субстрата [43, 44].

Интерпретация результатов изучения фармакокинетики этанола и активности этанол-метаболизирующих ферментов. Использование метода газовой хроматографии (пункт 8.1.) позволяет регистрировать влияние изучаемых веществ на обусловленные этанолом процессы с помощью фармакокинетических показателей, которые отражают характер их влияния на всасывание, распределение, катаболизм и выделение метаболитов этанола; в случае использования энзиматического подхода косвенно (пункт 8.2.) исследуют характер влияния изучаемых веществ на активность

330