3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

Вещество с предполагаемой нейролептичекой активностью вводится внутрибрюшинно или перорально за 60 мин до декапитации крыс. Структуры мозга (стриатум, прилежащее ядро перегородки, гипоталамус и др.) выделяют на холоде, замораживают

вжидком азоте и взвешивают. При анализе моноаминов навеску ткани гомогенизируют

в20 объемах 0,1 н НСIO4, с добавлением ДОБА (0,5 нмоль/мл). Затем образцы центрифугируют при 15 000 g в течение 5 мин. Для определения катехоламинов, серотонина (5-ОТ), 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК), 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и гомованилиновой кислоты (ГВК) 20 мкл чистого надосадка наносят на колонку путем прямой инъекции. Разделение изучаемых веществ проводят на хроматографе типа LC-304 Т (ВАS), снабженном инжектором 7125 Reodyne 20 мкл петлей для нанесения образцов. Используют колонку Biophase RP-18 октадецилсилановую 4,6 250 мм, защищенную предколонкой RP-18 4,6 мм 30 мм, 20 мкм колонку термостатируют при 45°С. В качестве детектора используют амперометрический детектор LC-4B со стеклоуглеродным электродом TL-5. Потенциал, приложенный к рабочим электродам, составляет +850 мВ против Ag/AgCl электрода сравнения RE-3. Скорость потока — 1 мл/мин. Для определения катехоламинов, серотонина, 5-ОИУК, ДОФУК и ГВК используют следующую подвижную фазу. Маточные растворы 0,02 М лимонной кислоты и 0,02 М

NaH2PO4, буфера, содержащего 0,269 мМ ЭДТА, смешиваются в пропорции 2,45:1. Затем добавляется 0,3 мМ ОСН и 10% ацетонитрила, рН = 3,0 устанавливается добавлением фосфорной кислоты. Подвижную фазу фильтруют, применяя вакуумный насос, через целлюлозные фильтры (0,2 мкм) типа «Миллипор» или «Владипор».

Известные нейролептики вызывают повышение содержания метаболитов ГВК и ДОФУК, что свидетельствует об увеличении скорости метаболического оборота дофамина. Последнее может рассматриваться как компенсаторная реакция, развивающаяся в ответ на блокаду дофаминовых рецепторов нейролептиками.

По этому тесту типичные нейролептики более активны, чем атипичные. Определение содержания аминов и их метаболитов в различных структурах мозга позволяет выявить структурную избирательность действия веществ. Используют, как правило, стриатум, прилежащее ядро перегородки, фронтальную кору мозга.

Для более детальной характеризации взаимодействия новых соединений с нейротрансмиттерными системами мозга рекомендуется использовать методику определения скорости метаболического оборота моноаминов с применением ингибитора декарбоксилазы L-ароматических аминокислот (соединение NSD-1015), а также технику внутримозгового микродиализа, позволяющую оценить влияние вещества на пресинаптическую регуляцию биосинтеза и высвобождения нейротрансмиттера (дофамина, серотонина). Последние методы могут рассматриваться как дополнительные.

3.2.Метод внутримозгового микродиализа

у свободноподвижных животных

Методика внутримозгового микродиализа у свободноподвижных животных может использоваться для определения внеклеточного содержания моноаминов мозга в дорзальном и вентральном стриатуме (прилежащее ядро) в условиях in vivo. Известно, что соединения с нейролептической активностью повышают внеклеточное содержание метаболитов ДА — ДОФУК и ГВК. В исследовании используются концентрические микродиализатные зонды CMA12 (CMA/Microdialysis AB, Швеция).

Крыс наркотизируют хлоралгидратом (400 мг/кг, в/б) и фиксируют в стереотаксисе. Затем, в прилежащее ядро имплантируют направляющие канюли для микродиализных зондов CMA12 с проницаемостью 20000 ДА (CMA Microdialisys) по координатам AP + 1,7 мм; L – 2,6 мм; DV – 8,2 мм [11], под углом 10 градусов к сагиттальной плоскости и фиксируют их к костям черепа. Через 48 ч после операции зонды помещают в направляющую канюлю и в течение двух часов производят перфузию искусственной цереброспинальной жидкостью со скоростью 2 мкл/мин [3]. Сбор диализатов происходит

261

каждые 20 мин. В течение первых 60 мин собирают 3 базальных образца, затем животным внутрибрюшинно вводят изучаемое соединение. После этого собирают еще 5–8 диализных проб. Содержание моноаминов и их метаболитов в диализатах определяют методом ВЭЖХ с электрохимической детекцией [10].

3.3. Модель прерывания импульсной активности нейронов (гаммабутиролактоновая модель)

Одним из наиболее информативных подходов к характеризации фармакологических свойств соединений с нейролептической активностью может быть изучение способности веществ устранять эффект агонистов ДА рецепторов, подавляющих синтез дофамина, на модели прерывания импульсной активности нейронов (гамма-бутиролактоновая модель). Введение гамма-бутиролактона (ГБЛ) в дозе 750 мг/кг, в/б, позволяет блокировать импульсную активность ДА нейронов [2]. При этом нарушается регуляция синтеза дофамина, которая осуществляется ДА нейронами черной субстанции и постсинаптическими рецепторами в стриатуме. В условиях пониженного уровня ДА в межсинаптической щели происходит снижение ингибирующего влияния Д2 ауторецепторов на тирозингидроксилазу (ТГ) — фермента, лимитирующего скорость синтеза ДА. Нейролептики, конкурируя с агонистами ДА рецепторов за места связывания пресинаптических рецепторов ДА, повышают активность ТГ и, следовательно, скорость синтеза ДА. Применение ингибитора декарбоксилазы ароматических аминокислот — NSD-1015 в гаммабутиролактоновой модели позволяет оценить влияние исследуемого вещества на способность ТГ синтезировать предшественник ДА — диоксифенилалланин (ДОФА), который в нормальных условиях практически не определяется. Для определения содержания ДОФА и моноаминов в структурах мозга рекомендуется использовать ВЭЖХ/ЭД, описанный выше (раздел 3.1).

3.4. Изучение влияния на уровень секреции пролактина

Секреция пролактина регулируется дофаминергическими волокнами тубероинфундибулярного тракта, берущего начало в области аркуатного и перивентрикулярного ядер гипоталамуса. Дофаминовые рецепторы преимущественно Д2 подтипа локализованы на секреторных клетках переднего гипофиза, где они выполняют функцию ингибиторного контроля секреции пролактина. Нейролептики при введении людям или экспериментальным животным, блокируя Д2 дофаминовые рецепторы, вызывают усиление секреции пролактина, что может быть причиной таких нежелательных побочных эффектов, как галакторея, аменорея, бесплодие, гиперплазия молочной железы.

Нейролептики нового поколения, благодаря своему низкому сродству к Д2 рецепторам тубероинфундибулярной системы, как правило, не вызывают пролактинемию.

Для оценки возможного влияния нового соединения с предполагаемой нейролептической активностью на дофаминергическую передачу в тубероинфундибулярной системе крысам вводят вещество в терапевтической дозе однократно или в течение 2 нед., определяя уровень пролактина в плазме крови радиоиммунологическим методом.

Заключение

Применение широкого набора тестов поведенческого, радиолигандного и биохимического анализа позволяет с достаточно высокой степенью вероятности выявить соединения, обладающие антипсихотическим эффектом, и предсказать особенности их действия в клинических условиях.

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.

262

ГЛАВА 16

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ

ТРАНКВИЛИЗИРУЮЩЕГО (АНКСИОЛИТИЧЕСКОГО) ДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: д. м. н., проф. Т.А. Воронина; академик РАМН С.Б. Середенин; к. б. н. М.А. Яркова; к. б. н. М.В. Воронин

Введение

Анксиолитические (син. транквилизирующие, антитревожные, антифобические, атарактические, психорелаксирующие) средства представляют группу психотропных веществ, применяемых для лечения различных невротических, неврозоподобных, психопатических и психопатоподобных состояний, сопровождающихся тревогой, страхом, беспокойством, повышенной раздражительностью, эмоциональной лабильностью, бессоницей, возбуждением, напряженностью. Анксиолитики эффективны при эмоциональном стрессе, фобиях, навязчивостях, ипохондрических синдромах, неглубоких депрессивных состояниях, психогенных психозах, панических состояниях. Больными с хроническим течением заболевания анксиолитики часто употребляются постоянно и являются жизненно необходимыми препаратами. Препараты этой группы применяются также как снотворные и противосудорожные средства, используются для купирования алкогольной и наркоманической абстиненции и в период ремиссии больных хроническим алкоголизмом, назначаются для премедикации при подготовке к хирургическим операциям и т.д. Анксиолитики применяются и в амбулаторной практике при стрессе, различных экстремальных ситуациях и здоровыми людьми, деятельность которых связана с работой в чрезвычайных и осложненных условиях.

Термин «транквилизатор» появился в 1957 году и произошел от латинского «tranquilloare» — успокаивать, делать безмятежным, и успокаивающие средства подразделились на большие транквилизаторы, которые потом составили группу антипсихотических средств (нейролептиков), и малые транквилизаторы, которые образовали группу анксиолитиков (anxiety — тревога).

К настоящему времени группа анксиолитиков включает более 100 препаратов, которые относятся к различным классам химических соединений и отличаются по механизму действия. Наиболее известными анксиолитическими средствами, применяемыми в клинике уже почти 40 лет, являются препараты бензодиазепиного ряда (диазепам, феназепам, хлордиазепоксид, оксазепам, лоразепам, гидазепам, медазепам и др.). Спектр их фармакологической активности, кроме специфического анксиолитического эффекта, включает другие проявления действия: противосудорожное, седативное, амнезирующее, миорелаксантное, что не является желательным при лечении невротических состояний. Кроме того, при длительном применении бензодиазепинов возможно возникновение лекарственной зависимости.

В последние годы появились анксиолитики нового типа, с большей избирательностью собственно анксиолитического эффекта и меньшими побочными эффектами. В противоположность классическим бензодиазепинам, являющимся прямыми агонистами бензодиазепиновых рецепторов, новые вещества обладают тропностью к определенным подтипам бензодиазепиновых, ГАМК рецепторов, имеют свойства агонистов-

264

антагонистов, частичных агонистов этих рецепторов, оказывают модулирующее влияние на ГАМК-бензодиазепиновый рецепторный комплекс (мексидол, афобазол). В лечебную практику внедряются препараты с серотонинергическим механизмом действия: агонисты серотонин-1А и дофаминовых рецепторов (буспирон, гепирон, ипсаперон и др.), антагонисты серотонин-2 рецепторов (ритансерин, пиренпирон, ципрогептадин и др.) и серотонин-3 рецепторов (ондансетрон, закоприд и др.) и ингибиторы обратного захвата серотонина (флуоксетин, венлафаксин и др). Избирательным анксиолитическим эффектом обладают лиганды сигма-1 рецепторов (афобазол). Поиск новых анксиолитиков ведется среди веществ, влияющих на аденозиновую, интерфероновую, опиоидную, нейропептидную системы. Исследуются: антагонисты кортиколиберина, холецистокинина, нейрокининовых рецепторов 2-го, 3-го и особенно 1-го типа, соматостатиновых рецепторов 3-го и 1-го типа, агонисты нейропептида Y и др.

Классическая методология изучения анксиолитических средств сложилась на основе изучения фармакологических свойств широко известных препаратов бензодиазепинового ряда. Однако появление анксиолитиков нового типа с различным и поликомпонентным механизмом действия требует и новых методических подходов к их изучению, расширения, уточнения и изменения традиционной программы исследования.

Внастоящих рекомендациях представлен унифицированный методический подход

кизысканию и изучению веществ с различным механизмом действия, обладающих анксиолитической (транквилизирующей) активностью и предлагаемых для клинического изучения.

1.Методы изучения специфической анксиолитической активности

Всвязи с многообразием методов, используемых для изучения анксиолитической активности, представляется целесообразным выделить основные, базисные методы исследования, которые дают наиболее полную информацию и являются общепринятыми в России и за рубежом и таким образом являются наиболее желательными при изучении нового препарата, и дополнительные методы, расширяющие представления о специфической анксиолитической активности.

1.1. Исследования, доказывающие наличие анксиолитической активности по базисным поведенческим тестам

Исследования, проводимые с использованием методов, представленных в данном разделе, являются определяющими для препарата и поэтому должны быть выполнены с соблюдением следующих требований.

По каждому тесту следует использовать вещество не менее чем в 3-х дозах, рассчитанных в соответствии с ЛД50 соединения (не более 1/10 от ЛД50).

Должен быть использован такой способ введения вещества, который соответствует предполагаемому клиническому способу применения препарата.

По меньшей мере по одному из основных тестов должна быть изучена кривая зависимости доза–эффект в возможно более широком диапазоне доз и определена продолжительность анксиолитического эффекта при использовании того пути введения, который соответствует предполагаемому клиническому применению.

Исследование анксиолитической активности должно быть обязательно проведено в сравнение с наиболее известными эталонными препаратами.

В связи с разнообразием вариантов используемых методик каждый используемый метод должен быть подробно описан в соответствующем разделе перед изложением результатов.

При проведении исследований следует использовать не менее трех методов, которые основаны на наказуемом поведении (тест конфликтной ситуации по Vogel) и на ненаказуемом поведении (методика приподнятого крестообразного лабиринта), и третий тест по выбору.

265

1.1.1. Методика конфликтной ситуации по Vogel

Методика конфликтной ситуации по Vogel, основанная на создании у животных состояния беспокойства, тревоги и страха с использованием наказующего раздражителя, подавляющего проявления условного или безусловного поведения, используется для оценки анксиолитиков уже почти 40 лет, является наиболее широко применяемой методикой при оценке транквилизаторов с момента их появления и обязательно используется при оценке анксиолитиков нового поколения. Данная методика позволяет оценить анксиолитические/анксиогенные эффекты веществ разного химического строения и механизма действия. На этой модели выявляются анксиолитические эффекты транквилизаторов первого поколения (этанол, барбитураты, мепробамат, триоксазин), препаратов, реализующих свое действие через системы ГАМК и возбуждающих аминокислот, адрено-серотонин-, дофаминергические, опиоидные системы, а также анксиолитические/анксиогенные эффекты гормонов, нейропептидов, нейротрофинов [1, 2, 11, 22, 32, 38].

Наиболее известной и широко применяемой методикой конфликтной ситуации является модель в варианте Vogel [42], создаваемая у грызунов путем подавления болевым электрическим раздражителем питьевого рефлекса при потреблении ими воды (пищи) из чашки или трубки-поилки и основанная таким образом на столкновении двух мотиваций — питьевой и оборонительной (страха наказания при попытке удовлетворения питьевой потребности) [1, 2, 8, 10, 32]. Классическая методика конфликтной ситуации по Vogel воспроизводится на крысах. Однако в последние годы методика конфликтной ситуации по Vogel модифицирована для мышей различных видов и также используется для оценки новых анксиолитиков [13].

Принцип методики конфликтной ситуации состоит в том, что наказующий фактор подавляет привычное для животного поведение, в результате чего создается ситуация невозможности осуществления необходимой мотивации, рассогласование желаемого и действительности, что подкрепляется страхом получения болевого раздражения. Эффект анксиолитиков заключается в преодолении страха перед наказующим фактором и в восстановлении значимого для животного поведения, что выражается в увеличении числа наказуемых ответов, в данном случае взятий воды, несмотря на получение при этом болевых раздражений. Методика имеет хорошую воспроизводимость, четкие контроли и высокую степень корреляции с клиническими эффектами.

Одним из вариантов методики [8] является следующий. Предварительно крыс лишают воды на 48 ч, не ограничивая пищу, и затем вырабатывают навык взятия воды из поилки, помещая крысу в камеру, где она находит поилку с водой и начинает пить. Камера имеет размер 275×275×450 мм, электродный пол и поилку с водой (сосуд с соском на стене), расположенную на высоте 5 см от пола. На следующий день крысу помещают в камеру на 10 мин и через 10 с после начала питья каждое взятие воды наказывается электроболевым раздражением (от 0,2 до 1 мА). В результате, чтобы удовлетворить питьевую мотивацию, крыса должна преодолеть чувство страха перед наказанием. Число наказуемых взятий воды за 10 мин нахождения в камере является мерой анксиогенного состояния. Анксиолитики устраняют чувство тревоги и страха и увеличивают число наказуемых взятий воды.

1.1.2. Методика приподнятого крестообразного лабиринта

Методика основана на навыке предпочтения грызунами темных нор, естественного страха нахождения на открытых площадках и падения с высоты. Описание и оценка метода наиболее подробно представлены в работах [21, 41, 29, 35, 36].

Одним из вариантов приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) является установка, которая состоит из крестообразно расходящихся от центральной площадки под прямым углом 4-х рукавов: два противоположных, открытых, без стенок, и два закрытых, темных. Центральная площадка и пол открытых рукавов, как правило, прозрачны, тог-

266

да как пол и стенки закрытых рукавов покрашены в темный цвет. Эксперименты проводятся как при обычном освещении, так и при дополнительном освещении открытых рукавов. Наиболее часто используемые размеры ПКЛ для крыс: рукава 10×10×50(60) см, центральная площадка 10×10×10 см, ПКЛ приподнят на 80–100 см; для мышей рукава составляют 5×5×20 (25) см, центральная площадка — 5×5×5 см, ПКЛ приподнят на 25(30) см. Непосредственно перед началом эксперимента животных выдерживают (от 3-х до 5-ти мин) в темных клетках. Затем животное помещают в ПКЛ на центральную площадку, головой к открытому рукаву и в течение определенного интервала времени (5 мин или 5+5 мин, или 3+3 мин, или поминутно 5 мин) регистрируют время пребывания животных в открытых, закрытых рукавах, а также на центральной площадке, количество заходов в открытые и закрытые рукава, латентный период первого захода в открытый рукав, число свешиваний с открытых рукавов.

Контрольные интактные животные предпочитают большую часть времени проводить в закрытых, темных рукавах. Анксиолитический эффект препарата оценивается по увеличению числа заходов в светлые рукава и времени нахождения в них, без увеличения общего числа заходов и по числу свешиваний с открытых рукавов. Время нахождения на центральной площадке позволяет оценить показатель принятия решения. По общему числу заходов в открытые и закрытые рукава и вертикальным стойкам можно оценить общую двигательную активность. Эмоциональность крыс оценивается также по числу мочеиспусканий и болюсов.

В некоторых исследованиях используется приподнятый zero-лабиринт, который представляет собой кольцевую приподнятую платформу с чередуемыми двумя открытыми и двумя закрытыми четвертями круга.

1.1.3.Поведение в открытом поле мышей с активным (линия С57Bl/6)

ипассивным (линия Balb/C) типами эмоционально-стрессовой реакции

Известно, что в зависимости от индивидуальных, наследственных, конституционных

характеристик эмоционально-стрессовое воздействие по-разному влияет на отдельных особей. У одних — стрессовый ответ сопровождается активацией деятельности и ее продуктивности, а у других эмоциональный стресс приводит к дезорганизации поведения или к пассивному отстранению от решения проблем. Генетическая гетерогенность популяции по эмоционально-стрессовой реакции и зависимость эффекта транквилизаторов от характера поведения выявляется и в эксперименте, особенно отчетливо в условиях методики открытого поля.

Методика открытого поля в традиционном варианте, как известно, широко используется в психофармакологии для изучения влияния веществ на оринтировочноисследовательское поведение, двигательную активность и для выявления анксиолитического действия. Однако без учета характера эмоционально-стрессовой реакции животных в условиях этой модели анксиолитическое действие не выявляется отчетливо. В противоположность этому оценка транквилизаторов с использованием фармакогенетического подхода с анализом фенотипических особенностей позволяет не только выявить специфический анксиолитический эффект, но и отдифференцировать его от других проявлений действия [9, 10, 30]. Особенно продуктивен этот подход для выявления и оценки селективных анксиолитиков [39, 40].

Методика освещенного открытого поля представляет собой квадрат или круг со стенками и прозрачной крышкой. Вариантом методики для мышей может служить камера, размером 40×40×20 см с прозрачной крышкой. Пол камеры равномерно разделен линиями на 9 квадратов с 16 отверстиями диаметром 2 см. Предварительно мышей инбредных линий С57Bl/6 и Balb/C перед экспериментом в течение 3-х мин выдерживают в темноте, после чего помещают на один из периферийных квадратов открытого поля. Наблюдение за животным производится в течение 3–5 мин, как правило, с поминутной регистрацией. Фиксируется число пересеченных квадратов на периферии и в центре (отдельно), число

267

вертикальных стоек, число заглядываний в отверстия, количество болюсов и мочеиспусканий. У мышей линии С57Вl/6 обмечается активный тип реакции на эмоциональнострессовое воздействие, а у мышей линии Balb/С — наоборот, пассивный тип поведения.

Анксиолитики оказывают отчетливый анксиолитический эффект у животных с пассивным типом поведения, выражающийся в устранении состояния застывания (freezing), страха, испуга и в активации поведения. В противоположность этому у мышей с активным типом поведения транквилизаторы вызывают седативный эффект. Высокую прогностическую значимость данная модель имеет не только при оценке классических транквилизаторов бензодиазепинового ряда, но и при изучении транквилизаторов нового поколения, атипичных препаратов с расслоением анксиолитического и седативного эффектов и избирательных, селективных анксиолитиков.

1.1.4. Методика четырех пластин

Метод 4-х пластин основан на подавлении ориентировочно-исследовательского поведения грызунов электроболевым раздражителем [14, 20]. Крысу (мышь) помещают на одну из четырех пластин, составляющих пол камеры, и после ознакомления с обстановкой (15–30 сек), при переходе животного с пластины на пластину, оно получает болевое раздражение, подаваемое через пол, в результате чего повышается уровень тревожности и уменьшается число переходов. Эффект анксиолитиков заключается в уменьшении страха получения болевого наказания и в увеличении числа переходов по пластинам.

1.1.5. Методика оценки поведения в темной/светлой камере

Методика светлой/темной камеры использует естественное стремление грызунов избегать ярко освещенных мест и по идеологии близка к методике приподнятого крестообразного лабиринта [16]. Животных помещают в ярко освещенный отсек двухкамерной светлой/темной установки и за определенный период времени (3–5 мин) регистрируют число переходов между светлым и темным отсеками, длительность пребывания в светлом и темном отсеках. Анксиолитики увеличивают число переходов из одного отсека в другой и время нахождения в светлом отсеке.

1.1.6. Методика условного защитного закапывания

Методика условного защитного закапывания у грызунов относится к филогенетическим моделям анксиогенеза, где также присутствует наказующий фактор [17, 37]. Сначала крыса (мышь) получают болевое раздражение через определенный предмет, например стержень, вмонтированный в пол или стену. При повторных посадках в камеру животные предпринимают попытки закапывания наказующего предмета элементами подстилки, например, шариками, стружками, сгребаемыми лапами с пола камеры. Продолжительность закапывания оценивается как показатель тревожности. Анксиолитики обладают способностью уменьшать продолжительность этой реакции животного.

1.2. Дополнительные исследования по расширенному изучению анксиолитической активности

1.2.1. Методика конфликтной ситуации по Geller, Seifter

Методика Geller, Seifter основана на наказании болевым раздражением питьевого или пищевого рефлексов при оперантном поведении в камерах Скиннера, которые вырабатываются при подкреплении с помощью нажатия на рычаг или педаль (для грызунов) или «клевания» (для птиц) [24, 15, 28]. В отличие от классического условного рефлекса, когда реакция животного определяется вызывающим ее раздражением, выработка оперантного рефлекса характеризуется установлением временной последовательности между реакцией животного, проявляющейся время от времени в данной ситуации, и подкрепляющим раздражителем. При оперантном поведении подкрепление подается в раз-

268

личных режимах, либо периодически через фиксированные (FI) или переменные (VI) интервалы времени, либо с фиксированным (FR) или переменным (VR) отношением к числу условных реакций, и конфликтная ситуация осуществляется на этом фоне.

Конфликтная ситуация по Geller, Seifter хорошо формируется на основе камер Скиннера фирмы «Lafayette Instrument Co» (США) [5]. Сначала у крыс с питьевой депривацией осуществляют обучение в режиме FR4, когда животное получает подкрепление водой после 4-х нажатий на рычаг. Затем у этих же крыс вырабатывается оперантный рефлекс по VI30 расписанию, когда оперантный рефлекс осуществляется в варьирующем интервале 30 с, и после выработки этого рефлекса оба расписания совмещаются. Далее в период выполнения нажатий по расписанию FR4 вводится наказующий удар током. В результате крысы осуществляют оперантную деятельность по VI расписанию с высоким уровнем выполнения (около 180 нажатий за 3 мин), что позволяет оценить седативное или активирующее действия препарата, а по наказуемому расписанию FR4 работают с низкой частотой (около 5 нажатий за 3 мин), что позволяет оценить анксиолитическое действие препаратов, которые избирательно увеличивают оперантные ответы в FR фазе.

Результаты исследований по этому тесту стабильны и имеют высокую прогностическую значимость. Однако трудоемкость методики (для выработки рефлексов требуется месяцы), необходимость ежедневной тренировки животных, использование дорогостоящего оборудования ограничивает ее применение.

1.2.2. Методика внешнего торможения

Методика внешнего торможения условных рефлексов активного избегания в камере шаттл-бокс или питьевых рефлексов в лабиринте [1]. Принцип метода состоит в том, что у крыс сначала вырабатывается условный рефлекс, а затем в момент его выполнения включается сильный световой раздражитель, который выполняет роль внешнего торможения поведения, стрессирует животное и затрудняет выполнение условной реакции. Действие анксиолитиков заключается в устранении стрессорной ситуации и восстановлении условно-рефлекторной деятельности.

1.2.3. Методика социального обследования (контактирования) у крыс

Молодая крыса-самец — интрудер (незваный, вторгающийся) — помещается к взрослой половозрелой крысе — резиденту, и фиксируется продолжительность активных социальных контактов (обнюхивание, облизывание, груминг, покусывание и т.д.) [23]. В этой ситуации наблюдается низкий уровень социального контакта интрудера с резидентом. Введение крысе-интрудеру анксиолитика увеличивает время, проводимое в социальных контактах с резидентом.

1.2.4. Методика изоляционного синдрома

Используют феномен нарушения поведения, возникающего у крыс (мышей) после длительной (4–12 недель) изоляции [31]. После изоляции одна группа животных становится агрессивной, а другая «починенной (тимидной)». Исследуется влияние транквилизаторов на поведение животных обоих типов, в особенности при контакте «изолированного» животного с подсаженным к нему в клетку животным, не проходившим изоляцию (интрудером).

1.2.5. Методики агрессивного поведения

Наиболее известной и простой моделью является методика агрессивного поведения пары крыс (мышей), спровоцированного электроболевым раздражением через электродный пол [1]. Регистрируется число схваток между животными и порог их возникновения (по величине подаваемого на пол тока) агрессивной реакции. Агрессивное поведение создается также раздражением или удалением некоторых структур мозга, использованием межвидовой агрессивности, например, между кошкой и собакой, кошкой и мышью, или

269

естественной агрессивности некоторых видов диких животных. Большинство транквилизаторов обладают способностью уменьшать проявления агрессивного поведения животных.

1.2.6. Неизбегаемое электроболевое раздражение лап животных или иммобилизация путем фиксации лап или тела

Стрессорная ситуация, вызываемая неизбегаемым электроболевым раздражением лап животных [25] или иммобилизацией путем фиксации лап или тела мелких лабораторных животных [33], оказывает сильное воздействие на животное, вызывая нередко необратимые изменения. Под влиянием транквилизаторов наблюдается улучшение в состоянии животных.

1.2.7. Стресс по Жуве

Стресс по Жуве осуществляется путем помещения крыс на малые площадки в бассейн с водой на 24 ч, что создает условия гиподинамии, изоляции и депривации парадоксальной фазы сна. В стрессорной ситуации наряду с нарушением нейромедиаторного баланса наблюдаются стойкое денатурационное изменение белков мембранных структур, усиление процессов перекисного окисления липидов. Нарушение поведения крыс выражается в повышении уровня тревожности и эмоциональности, изменении ориентировочно-исследовательского и целенаправленного поведения, ухудшении процессов обучения [3]. Транквилизаторы, особенно атипичные, устраняют различные проявления нарушений, возникающих при этом виде стресса.

1.2.8. Методика обратимого функционального нарушения ЦНС (сбой рефлекса избегания)

Методика обратимого функционального нарушения ЦНС (сбой рефлекса избегания) построена на основе нарушения однозначности причинно-следственных отношений между раздражителями, реакцией и ее следствиями применительно к челночной камере. При этом нарушается однозначность отношений как между условным и безусловным раздражителями, так и между реакцией и ее следствием, что вызывается включением звука после выключения тока и тем, что реакция животного уже не приводит к обычному выключению тока. В результате возникает прагматическая неопределенность ситуации, срыв высшей нервной деятельности, что выражается в эмоциональной напряженности, появлении состояния тревоги и страха [7]. Транквилизаторы устраняют проявления сбоя рефлекса избегания.

1.2.9. Методика пространственной переделки рефлекса избегания в челночной камере

У крыс с уже сформированной реакцией избегания меняют место нахождения отверстия для перехода в другой отсек челночной камеры, что приводит к нарушению выполнения выработанного навыка, уменьшению числа реакций избегания и увеличению числа межсигнальных реакций [7]. Транквилизаторы уменьшают число межсигнальных реакций в этой ситуации.

1.2.10. Условная эмоциональная реакция в камере Скиннера

Предварительно у крыс вырабатывается оперантный рефлекс в камере Скиннера с нажатием на рычаг. Затем животные получают неизбегаемое электроболевое раздражение через электродный пол, сочетаемое с условным сигналом. При повторной посадке животного в камеру включение только условного сигнала вызывает эмоциональную напряженность и уменьшение оперантных реакций. Транквилизаторы увеличивают число оперантных ответов, подавленных условным сигналом [38]. Условную эмоциональную реакцию у животных можно вызвать и в других камерах при сочетании звукового (светового) сигнала с болевым раздражителем.

270