3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

Мышам коразол вводят в подпороговой дозе, как правило, 30 мг/кг внутрибрюшинно с интервалами не менее 24 ч. Крысы получают коразол в дозе 35 мг/кг по той же схеме. Оценку судорожных реакций у животных определяют по 4-балльной шкале: 0 баллов — отсутствие судорожных реакций, 1 балл — подергивания головы или отдельных мышц тела, 2 балла — серийные повторные подергивания всего тела, 3 балла — клоникотонические судороги с «позой кенгуру» и «барабанный бой». 4 балла — клоникотонические судороги с падением набок и постприступной депрессией, повторные клонико-тонические судороги и смерть. Наблюдения проводятся в течение 25 мин после введения коразола.

2.1.9. ЭЭГ исследование первично-генерализованной эпилептиформной активности, вызванной бемегридом

Первично-генерализованная эпилептиформная активность (ЭпА) в эксперименте создается в основном на крысах при внутримышечном введении 0,5% раствора бемегрида в дозе 10 мг/кг или коразола в дозе 25–30 мг/кг. Эксперименты проводятся на крысах массой тела 250–280 г с хронически вживленными электродами в сенсомоторную кору (координаты: 1,5–2 мм вперед или назад от брегмы и 2 мм вправо или влево от сагиттального шва) и некоторые подкорковые структуры, наиболее часто — в область дорзального гиппокампа (координаты: 3 мм назад от брегмы, 3 мм вправо или влево от сагиттального шва, на глубину 3 мм от поверхности кости) или миндалевидный комплекс. Операция по вживлению хронических электродов осуществляется, как правило, под нембуталовым наркозом за 5 дней до проведения эксперимента. Запись электрической активности обычно проводят в условиях свободного передвижения животного по камере. Регистрация биопотенциалов мозга осуществляется на чернилопишущем электроэнцефалографе или любым другим способом, позволяющим регистрировать и количественно оценить изменения эпилептиформных разрядов в электрограммах исследуемых структур и оценить противосудорожный эффект препарата. Исследуемое вещество вводят за несколько мин до введения бемегрида таким образом, чтобы пик их активности приходился на пик активности бемегрида. Оценка противосудорожного действия веществ проводится по изменению числа разрядов за минуту, длительности отдельных разрядов и общей длительности разрядов за минуту. Предполагается, что в основе действия веществ на число разрядов и их длительность лежат различные механизмы, и антиэпилептические эффекты могут выражаться как в уменьшении числа разрядов, так и в снижении их длительности, либо в сочетании этих эффектов.

2.1.10. Судороги, вызванные коразолом у рыб (zebrafish –Danio rerio)

Введение рыбам (zebrafish) коразола вызывает у них стереотипное поведение и клонические судороги. Выраженность эффекта зависит от дозы коразола. Внеклеточная регистрация электрографических разрядов после введения коразола осуществляется из области optic tectum рыбы. Эпилептиформные электрические разряды блокируются тетродотоксином, а также вальпроатом и диазепамом, и эффект препаратов имеет дозозависимый характер [13].

3.Методики, моделирующие парциальные (фокальные)

ивторично-генерализованные судороги в хроническом эксперименте

Необходимость использования «очаговых» моделей эпилепсии при оценке действия

противоэпилептических препаратов очевидна, так как известно, что противоэпилептические средства, которые успешно применяются при первично-генерализованной эпилепсии, часто оказываются неэффективными при различных формах очаговой и вторичногенерализованной эпилепсии (у 20–30% больных). Кроме того, показано, что во многих случаях эпилепсии, имеющей первично-генерализованные формы, могут существовать трудно диагностируемые очаги-генераторы [7].

241

Наиболее адекватными моделями для воспроизведения в эксперименте парциальных (фокальных) психомоторных судорог являются методики киндлинга, вызываемого повторной электрической стимуляцией (начиная с подпороговых значений тока) миндалины, гиппокампа или других областей лимбической системы, и кобальтовая модель эпилепсии [20]. В условиях этих моделей развиваются фокальные судороги, которые имеют сходство с комплексными парциальными судорогами у человека. Если продолжать электрическую или химическую стимуляцию, в дополнение к фокальным судорогам развиваются вторичные генерализованные судороги. Однажды развившись, повышенная чувствительность к электрической или химической стимуляции остается постоянной. При этих моделях развивается хроническая дисфункция мозга, вызывающая не только повышенную чувствительность к судорогам, но и длительное нарушение поведения.

3.1. Методика киндлинга, вызванного электрической стимуляцией миндалины

Исследование проводится на белых крысах — самцах или самках, беспородных или линии Вистар. У анестезированных животных, используя стериотаксический прибор, вживляется один биполярный электрод в правую базолатеральную миндалину. Координаты электродов от брегмы — AP — 2.2, L — 4.7, V — 8.7. Индифферентный электрод помещают на череп над контралатеральной париетальной корой. После 2 недель после операции начинают моделирование киндлинга. Электрическая стимуляция миндалины осуществляется от электрического стимулятора (500 mА, 1 м/с, 50/с в течение 1 с) один раз в день до тех пор, пока не возникает 10-ти последовательных 5-стадийных судорог.

Оценку судорог при киндлинге осуществляют, как правило, по классификации Racine [29] по следующим стадиям: 1 — замирание, закрытие глазной щели, потергивание усов, принюхивание, фациальный клонус; 2 — наклон головы, связанный с более выраженным фациальным клонусом; 3 — клонус одной передней лапы; 4 — запрокидывание, часто связанное с билатеральным клонусом передних лап; 5 — запрокидывание с утратой равновесия и сопровождаемое генерализованными клоническими судорогами.

Электрическая активность миндалины регистрируется через биполярный электрод, вживленный в эту структуру мозга до и после стимуляции. Начинают стимуляцию с 10 mА и затем интенсивность увеличивается каждый день на 20% с интервалами в 1 мин, до тех пор пока не возникают разряды последействия продолжительностью более 3-х с — ЭЭГ спайки с амплитудой, по крайней мере в два раза превышающей обычную амплитуду, и частотой более 1/с. Определение порогов для разрядов последействия осуществляют с интервалами в два–три дня, до тех пор, пока все животные не воспроизводят судорожные пороги. У животных с киндлингом, кроме основного показателя — порога судорожной реакции, регистрируют длительность судорог — лимбических (стадии 1–2) и/или моторных судорог (стадии 3–5) и длительность разрядов последействия. Исследуемые вещества вводят животным со стабильным судорожным порогом и регистрируют ослабление описанных выше судорожных реакций. Повторные эксперименты на этих же крысах с тем же веществом или с другим препаратом можно проводить с интервалом в 7 дней. В заключение следует провести гистологические исследования по определению правильности нахождения биполярных электродов в миндалине [38].

Модель киндлинга, вызванная электростимуляцией миндалины, является наиболее распространенной моделью киндлинга. Однако кроме нее можно использовать киндлинг, вызванный электростимуляцией гиппокампа или других областей лимбической системы [43].

3.2. Методика эпилептогенного хронического очага, вызванного аппликацией кобальта у крыс

Эксперименты проводят на белых беспородных крысах-самцах массой тела 180–220 г с хронически вживленными электродами. Эпилептогенный очаг создается аппликацией

242

порошка металлического кобальта на поверхность сенсомоторной коры левого полушария (координаты — 1.5 мм, вперед от брегмы и 1.5–2 мм латеральнее сагитального шва). Операции проводят в условиях анестезии (как правило, под нембуталовым наркозом — 40 мг/кг, в/м). В черепе крысы просверливается отверстие диаметром 1 мм, в которое насыпают порошок металлического кобальта на высоту 2 мм. Канюлю закрепляют на поверхности черепа при помощи висват-цемента или любой зубопротезной быстротвердеющей пластмассы. Одновременно в мозг крысы вживляют электроды, изготовленные из нихромовой проволоки (диаметром 90–120 микрон), в лаковой изоляции для регистрации электрограмм. Концы электродов припаивают к посеребренным штырькам, которые закрепляются на кости черепа, так же как и канюля. Электроды вживляют в ипсилатеральную и контрлатеральную (по отношению к очагу) зону сенсомоторной коры и некоторые структуры лимбико-гипоталамического комплекса. Индифферентный электрод вживляют в носовую кость черепа. Биоэлектрическую активность исследуемых структур регистрируют у свободно передвигающихся животных ежедневно начиная со 2-го дня после аппликации кобальта. Ежедневное мониторирование электрической активности мозга крыс позволяет выявить особенности развития эпилептической системы в различные сроки после аппликации эпилептогена и выбрать наиболее информативные периоды для воздействия антиэпилептическими средствами. Подсчитывают число и длительность разрядов в минуту, длительность одного разряда, а также латентное время возникновения отдельных пароксизмов в каждой исследуемой структуре, что позволяет определить наиболее точно место приложения вещества и сделать предположение о возможном механизме действия вещества.

В развитии эпилептиформной активности крыс с кобальтовым эпилептогенным очагом можно выделить стадии, различающиеся по электрофизиологическим и нейрохимическим характеристикам [4, 9, 10]. В первые два дня после операции в электрограммах всех исследуемых областей отмечаются эпилептиформные разряды, доминирующие в основном в электрограммах, записанных с поверхности двигательной коры в непосредственной близости от «эпилептогенного» очага. В это время у крыс отмечаются отдельные подергивания передней правой лапы или головы. Следует отметить, что на протяжении одного исследования в электрограммах одной и той же крысы могут присутствовать разнообразные пароксизмы: сгруппированные острые волны, высокоамплитудные острые волны, множественные пики, комплексы острых волн и комплексы «пик-волна».

К 3–4 дню после аппликации кобальта отмечается тенденция к генерализации эпилептиформной активности в зеркальный очаг и подкорковые структуры. К 5–6 дню после операции у всех крыс с кобальтовым эпилептогенным очагом регистрируются генерализованные эпилептиформные разряды, одинаковые по амплитуде и синхронно возникающие во всех исследуемых структурах, в это время у животных отмечаются подергивания правой и левой передних лап, головы и туловища. Генерализованная активность сохраняется обычно в течение нескольких дней, с постепенным нарастанием ее в электрограммах подкорковых образований. Затем отмечается постепенное ослабление ЭпА в «истинном» очаге и некоторое усиление в «зеркальном» очаге и подкорковых структурах. Приблизительно к концу второй недели после аппликации кобальта эпилептиформная активность в электрограммах всех исследуемых областей ослабевает, возникая лишь при световой или звуковой стимуляции.

Таким образом, в развитии ЭпА в электрограммах мозга крыс с кобальтовым эпилептогенным очагом в сенсомоторной области коры можно выделить три стадии: 1-й этап — начало развития эпилептической активности с наличием пароксизмальных разрядов в электрограммах коры ипсилатерального полушария и значительно меньшей выраженностью ее в других отведениях (24–48 ч после аппликации кобальта). 2-й этап — наличие генерализованных эпилептиформных разрядов как в контралатеральном полушарии, так и в подкорковых структурах (5–6 сутки). 3-й этап — уменьшение эпилептических разря-

243

дов в кортикограммах первичного (истинного) очага и сохранность их в электрограммах зеркального очага и подкорковых структур (14 суток).

Исходя из этого изучение влияния новых веществ на ЭпА желательно проводить отдельно на каждом этапе. Наиболее важно исследовать действие исследуемых веществ в начальной стадии развития эпилептической системы (1–2 день после аппликации кобальта и на стадии генерализации ЭпА (через 5–6 дней после аппликации эпилептогена). Оценивается способность веществ устранять или ослаблять проявления судорожной активности в электрограммах исследуемых структур мозга по числу разрядов за минуту, общей длительности разрядов за минуту и длительности отдельных разрядов в каждой исследуемой структуре. Влияние веществ на вторично-генерализованные судороги оценивали по изменению ЭпА в электрограммах зеркального очага и подкорковых структур.

3.3. Модель парциальных судорог, вызванных аппликацией оксида аллюминия в исследованиях на кошках

Для создания хронического эпилептогенного очага в экспериментах на животных используется применение оксида аллюминия в оспытах на кроликах и кошках. Эпилептиформная активность, регистрируемая в электрограммах сенсомоторной коры и подкорковых структур наблюдается в отдаленные сроки после аппликации эпилептогена и сохраняется в течение нескольких месяцев. Наиболее часто используется модель, предложенная Guerrrero-Figueroa [23] в исследованиях на кошках. Эпилептогенный очаг создается путем нанесения оксида аллюминия в одну из специфических структур мозга (дорзальный гиппокамп, миндалина и пр.). При введении эпилептогена в область дорзального гиппокампа правого полушария регистрирующие электроды вживляются кошкам через 1 месяц после имплантации эпилептогена, так как только к этому времени появляются заметные изменения электрической активности в зоне первичного очага. Электроды вживляются в оба гиппокампа, миндалину и сенсомоторную кору обоих полушарий. Анализ развития первичного и вторичных очагов и формирования эпилептической системы проводится по изменению характера эпилептиформной активности (ЭпА). Регистрируется число разрядов и их длительность. При этом ЭпА может регистрироваться как во время двигательных (моторных) пароксизмов, так и без них. У животных с гиппокампальными эпилептогенными очагами наблюдается повышенная агрессивность, изменяется эмоционально-поведенческий статус. Таким образом, эта модель может использоваться не только для оценки специфического влияния антиэпилептических веществ на ЭпА, но и оценки их влияние на эмоциональную сферу в поведении животных. Однако данная модель применима в условиях хорошо финансируемой фирмы, так как требует длительного содержания животных в условиях вивария.

Использование криогенных очагов эпилепсии требует специальной техники и оборудования, что затрудняет широкое применение этой модели при изучении противосудорожных веществ.

3.4. Модель парциальных судорог, вызванных аппликацией пенициллина

Эксперименты обычно проводятся на крысах линии Вистар или белых беспородных крысах-самцах массой тела 180–250 г. За сутки до эксперимента в черепе животных просверливаются отверстия 2×4 мм над симметричными областями сенсомоторной коры головного мозга и устанавливаются монополярные корковые серебряные электроды для отведения электрической активности с указанных областей. Очаги эпилептической активности создаются аппликацией фильтровальной бумаги, смоченной раствором натриевой соли бензилпенициллина в концентрации 20000МЕ/мл. Исследуемые антиэпилептические вещества вводят либо на фоне устойчивой эпилептиформной активности, либо за 30 мин до создания очагов. Электрокортикограммму регистрируют у свободно передвигающихся животных. Оценку противосудорожных свойств веществ проводят по

244

изменению амплитудно-частотных характеристик эпилептиформных разрядов, их числу и продолжительности существования очагов [22].

4. Модель эпилептического статуса

Эксперименты проводятся на белых беспородных крысах-самцах массой тела 220– 250 г с хронически вживленными электродами и кобальт-индуцированным эпилептогеннным очагом в сенсомоторной области коры. Эпилептогенный очаг создается по методике, описанной в пункте. Начиная с 4-го дня после аппликации кобальта, ежедневно проводят ЭЭГ-мониторинг. Когда у крыс появляются отдельные клонические подергивания передних лап и/или мордочки, а в электрограммах исследуемых структур мозга отмечается стойкая эпилептиформная активность, проводят провокацию эпистатуса. Обычно наиболее благоприятными являются сроки на 7–8 день после аппликации кобальта, когда у всех крыс отмечаются стойкие изменения электрической активности отдельные клонические подергивания передних лап или головы. Эпилептический статус вызывают внутримышечным введением тиалактоном гомоцистеина (DL-homocysteine thiolactone (НСТ) в дозе 5,5 ммоль/кг, разводимого в 3.5 мл/кг нормального физиологического раствора непосредственно перед использованием. Мониторирование электрической активности проводится сразу после инъекции НСТ и до конца эксперимента, что позволяет определить точное время наступления генерализованных клонико-тонических приступов (ГКТП) и определить временные интервалы между последовательными приступами [42]. Для оценки способности веществ устранять развившийся статус исследуемые вещества вводятся сразу после окончания второго приступа ГКТП. Контрольной группе животных в те же сроки вводят физиологический раствор в равных объемах. После этого наблюдение проводят не менее 30 мин. Способность веществ устранять эпилептический статус оценивается по уменьшению числа ГКТП, наблюдаемых после введения антиэпилептического вещества, и по длительности интервала между приступами ГКТП. Регистрируется процент животных, у которых после введения исследуемого вещества в различных дозах отсутствовали приступы ГКТН, и на основании этих данных рассчиты-

вается ЭД50.

Использование НСТ для провокации генерализованных тонико-клонических судорог у крыс с кобальтовым эпилептогенным очагом позволяет также оценить влияние веществ на вторично-генерализованные судороги. Развивающиеся при этом моторные и/ или электрографические приступы оцениваются по их длительности, числу и характеру. При оценке моторных судорог учитывается наличие отдельных подергиваний передних конечностей, головы или отдельных мышц тела, комплексные подергивания, клонико-тонические судороги с «позой кенгуру» и «барабанный бой», клоникотонические судороги с падением набок и постприступной депрессией, учитывается процент животных, у которых отмечается боковое положение. Кроме того, регистрируется появление агрессии или гиперактивности.

5.Генетические модели эпилепсии

5.1.Аудиогенные судороги у мышей линии DBA/2J

Исследования осуществляются на мышах линии DBA/2J возрастом 21–22 дня и массой 6–10 г. Мышей помещают в круглые пластиковые клетки (19–20 см диаметр) и включают звуковой сигнал 110 dB(12 kHz) в течение 60 с, регистрируя в этот период наличие судорог. Судороги оцениваются по балльной шкале: 0 — отсутствие судорог, 1 — дикий бег менее чем 10 с, 2 — дикий бег более 10 с, 3 — клонические судороги, 4 — экстензия передних конечностей/флексия задних конечностей, 5 — тонические судороги, 6 — остановка дыхания. Исследуемое соединение вводится до помещения животных в звуковую камеру. Статистические различия между контрольной и получавшими ЛС группами рассчитываются, как правило, по Mann-Whitney U-тесту.

245

5.2. Модель аудиогенной эпилепсии у крыс

линии Молодкиной-Крушинского и NEP крыс (Noda epileptic rats)

Аудиогенную эпилепсию моделируют и изучают на крысах линии КрушинскогоМолодкиной (КМ), для которых характерно наличие обусловленной эпилептиформной реакции на звуковое раздражение [12]. Крыс подвергают акустическому воздействию в звукоизолированной камере размером 30х55х45 см в течение 90 с (сила звука 60–120 дБ). Звук вызывает у крыс резкое двигательное возбуждение, переходящее в клонико-тонический припадок. Для оценки наблюдаемого эффекта используются следующие количественные показатели аудиогенной реакции: латентный период возникновения двигательного возбуждения в ответ на звуковое воздействие (в с), интенсивность судорожного припадка (в баллах от 0 до 4) и характер судорожной реакции (одноили двухволновой). Интенсивность судорожного припадка оценивается по следующей шкале: 0 баллов — отсутствие двигательного возбуждения, 1 балл — двигательное возбуждение (беспорядочный бег, прыжки), не заканчивающееся судорожным припадком, 2 балла — двигательное возбуждение, заканчивающееся падением животного на брюшко с последующими клоническими судорогами, 3 балла — двигательное возбуждение, заканчивающееся падением животного набок с клоническими судорогами, 4 балла — двигательное возбуждение с падением животного набок с тоническим напряжением всей мускулатуры и временной остановкой дыхания. Исследуемое вещество вводится до начала звуковой экспозиции, с таким расчетом, чтобы пик действия вещества приходился на время экспозиции. Оценка противосудорожных эффектов проводится по сумме баллов в контрольной и получавших ЛС группах, а также по изменению латентного времени возникновения двигательного возбуждения. Путем мутации выведены NEP (Noda epileptic rats) крысы, у которых каждые 30 ч спонтанно возникают тонико-клонические судороги без внешнего раздражения [33].

5.3.Исследования на линиях животных

сгенерализованными эпилептическими абсансами

Изучение антиэпилептических свойств веществ по способности угнетать абсансы проводятся на генетических или мутантных линиях животных. Известна генетическая линия крыс WAG/Rij с генерализованными эпилептическими абсансами. Эксперименты на этих крысах позволяют использовать не только электрофизиологические, но и поведенческие методы анализа. При этом анализируется влияние веществ на число и длительность разрядов «пик-волна» и характер поведения [40].

Мутантная линия летаргических мышей Lh/Lh, у которых отмечаются спонтанные эпилептические абсансы, также используется для оценки антиабсансной активности новых веществ [21]. Предполагается, что в механизме нарушений, связанных с эпилептическими абсансами, ключевую роль играет подтип ГАМК-Б рецептора, поэтому его агонисты усиливают судорожную активность и могут быть использованы для анализа антиабсансной активности. В связи с тем, что использование линейных животных не всегда доступно, в экспериментах на крысах абсансы могут быть вызваны введением пентилентетразола или гамма-оксибутирата [21].

6.Изучение спектра нейро-психотропной активности и побочных эффектов

Всвязи с тем, что известные противосудорожные препараты обладают, помимо основного, противосудорожного эффекта, другими проявлениями действия, следует изучить более подробно спектр нейро-психотропной активности нового препарата и получить сведения о его побочных эффектах. Следует получить данные о наличии или отсутствии

уизучаемого вещества седативного или активирующего, анксиолитического и миорелаксантного действия, исследовать его возможное влияние на память. Для выявления этих эффектов следует использовать общепринятые тесты: регистрацию поведения в открытом поле и в различных актометрах, тест залезания на сетку, методики конфликтной

246

ситуации и приподнятого крестообразного лабиринта; для изучения миорелаксантного действия используются тесты вращающегося стержня, рефлекса подтягивания на перекладине, удерживания на перевернутой сетчатой платформе, тест бокового положения. Изучение эффектов новых соединений на процессы обучения и памяти следует проводить с использованием методик условных рефлексов активного и пассивного избегания, лабиринтных моделей. Исследование этих эффектов проводится в диапазоне терапевтических доз, оказывающих противосудорожный эффект.

Для расширения представлений о механизме действия нового соединения следует изучить его влияние на проявления действия различных нейромедиаторных анализаторов, например, на эффекты ареколина, треморина, 5-окситриптофана, фенамина, резерпина, дофамина, апоморфина, флумазенила, дизоцилпина и других.

Изучение побочных эффектов следует осуществлять в более широком диапазоне доз: от средних терапевтических до субтоксических, использовать не менее двух видов животных и путь введения, соответствующий предполагаемому клиническому. Данные по побочным эффектам нового препарата сопоставляются с данными, полученными для эталонных препаратов. Информация о побочных эффектах дополняется результатами, полученными в разделе «Изучение общей фармакологической активности».

7. Изучение толерантности и возможной лекарственной зависимости при длительном применении противосудорожного препарата и его отмене

В связи с тем, что противосудорожные препараты применяются, как правило, длительными курсами, необходимо исследовать эффекты нового вещества при его длительном применении (введение не менее 1 месяца). При хроническом введении препарата изучается его переносимость и развитие толерантности по противосудорожным, сопутствующим и побочным эффектам. Кроме того, необходимо провести исследования по изучению возможного абстинентного синдрома при отмене препарата после его длительного введения.

8. Исследование механизма действия нового противосудорожного соединения

Представляются данные по изучению механизма действия, имеющиеся на настоящий момент. Поскольку патомеханизм развития эпилепсии до настоящего времени еще полностью не раскрыт и не ясны точные молекулярные мишени для воздействия новых противоэпилептических веществ, изучение механизма их действия осуществляется, как правило, на основе представлений о механизме действия известных препаратов. Рекомендуется оценить действие новых веществ на функционирование натриевых и кальциевых Т-каналов, исследовать их действие на ГАМК-ергическую и возбуждающую глутаматергическую нейропередачу. Поскольку в последние годы интенсивные и перспективные исследования ведутся среди антагонистов АМРА подтипов глутаматных рецепторов [30] или активаторов калиевых каналов [32], желательно получить данные о влиянии нового препарата на эти механизмы. В частности, с целью оценки роли глутамата и кальция в индукции и поддержании эпилептогенеза можно использовать модели current-clamp в опытах in vitro. На культуре нейронов гиппокампа показано, что однократная 30-минутная экспозиция глутамата вызывает повреждение нейронов, что приводит к появлению у них спонтанных повторяющихся эпилептиформных разрядов и высокочастотных спайков [18]. Антагонисты каннабиноидных рецепторов СВ1 вызывают активность, подобную эпилептическому статусу, на модели эпилепсии в опытах in vitro на культуре гиппокампальных нейронов [18].

Появлению новых мишений воздействия противоэпилептических веществ может способствовать исследование тканей из эпилептического очага человека или анализ генома человека с наследственной эпилепсией. Познания в этой области могут привести к созданию компенсаторной терапии.

247

9.Взаимодействие нового противосудорожного препарата

сдругими психотропными препаратами

Всвязи с широким использованием противосудорожных препаратов в наборе средств комбинированной терапии следует изучить комбинированное действие нового соединения с известными и наиболее часто применяемыми нейропсихотропными средствами, в частности, этанолом, снотворными, транквилизаторами, антидепрессантами

идр.

10. Изучение общей фармакологической активности противосудорожного препарата, влияния

на сердечно-сосудистую систему и дыхание

Наблюдение за состоянием животного осуществляется на мышах и крысах при введении препарата в широком диапазоне доз: от не оказывающих заметного влияния на общее состояние до вызывающих гибель. При этом определяется повышение или снижение общей возбудимости, увеличение или снижение двигательной активности, наличие тремора, судорожных подергиваний, судорог, гиперкинезов, изменение цвета кожных покровов, взъерошивание шерсти, каталепсия, птоз, стереотипия, груминг и т.д. Изучается пиннеальный, болевой и роговичный рефлексы, влияние на температуру тела, потребление воды и пищи.

Влияние на ССС, дыхание и на периферические отделы нервной системы изучается на интактных или наркотизированных кошках, кроликах или крысах по влиянию на уровень кровяного давления, ритм сердечной деятельности (желательно и других показателей работы сердца), дыхание, а также на реакции, вызванные введением нейромедиаторов, например, адреналина, норадреналина, ацетилхолина, серотонина, и в ответ на раздражение периферического отрезка блуждающего нерва и др.

11.Изучение фармакокинетики

ибиодоступности исследуемого вещества

Исследование фармакокинетики и биодоступности является необходимым и важным звеном исследования для любого препарата, и особенно с противосудорожным действием, в связи с необходимостью в последующем в значительном числе случаев осуществления фармакокинетического мониторинга в клинике. Изучение и расчет показателей фармакокинетики и биодоступности не отличается от таковых при изучении препаратов других типов действия.

Заключение

Изложенный выше комплекс методов позволяет выявить эффективные противосудорожные средства, определить их преимущества перед известными препаратами, возможные побочные эффекты и в дальнейшем предложить их для КИ в качестве противоэпилептических средств.

В заключении к отчету, представляемому в Минздравсоцразвития России, резюмируются данные, характеризующие всю совокупность противосудорожных эффектов представляемого соединения, а также сопутствующих нейротропных эффектов. Описываются выявленные побочные эффекты. Анализируются основные преимущества нового препарата перед известными средствами сходной направленности действия.

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.

248

Литература

1.Воронина Т.А., Вихляев Ю.И., Неробкова Л.Н. и др. Характеристика фармакологических свойств феназепама. Методы исследования. — Кн. Феназепам (ред. С.А. Андронати) — Киев: изд. Наукова Думка, 1982. — С. 145–150.

2.Воронина Т.А. Фармакология современных противосудорожных средств.- Антиконвульсанты в психиатрической и неврологической практике (ред. А.М. Вейн, С.Н. Мосолов). — СПб.: Мед. инф. агенство, 1994. — С. 3–30.

3.Гусев Е.И., Коновалов А.Н., Бурд Г.С. Неврология и нейрохирургия. — 2004. — 450 с.

4.Дюмаев К.М., Воронина Т.А., Смирнов Л.Д. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий ЦНС. — Издательство института биомедицинской химии РАМН, 1995.

5.Карпова М.Н., Глебов Р.Н., Панков О.Ю., Германе С.К., Клуша В.Е., Дубур Г.Я. Влияние блокатора СА-каналов риодипина на очаговую и генерализованную эпилептическую активность — Бюлл. экспер. биол. и мед., 1989. — Т. 108. —№ 11. — С. 553–554.

6.Крыжановский Г.Н. Киндлинг как модель формирования эпилептической активности. Успехи физиологических наук. — 1988. — Т. 19. — № 4. — С. 12–31.

7.Крыжановский Г.Н. Общая патофизиология нервной системы. — М., 1997.

8.Крыжановский Г. Н. Дизрегуляционная патология. — М., 2002.

9.Неробкова Л.Н., Воронина Т.А. Нарушение обучения и структуры сна у крыс с эпилептогенным кобальтовым очагом в сенсомоторной области коры. — Бюлл. эксп. биол. и мед., 1988. — № 4. — C. 397–400.

10.Поздеев В.К. Медиаторные процессы и эпилепсия. — Л.: Наука, 1983.

11.Середенин С.Б., Воронина Т.А., Незнамов Г.Г., Жердев В.П. Феназепам. 25 лет в медицинской практике. — М.: Наука, 2007. — 381 с.

12.Симеохина А.Ф., Федотова И.Б., Кузнецова Л.М. — Крысы линии Крушинского-Молодкиной как модель для изучения патологических состояний и методов их регуляции. Лаб. животные. — 1993. — Т. 3. — № 4. — С. 202–210.

13.Baraban SC, Taylor MR, Castro PA, Baier H -Pentylenetetrazole-Induced Changes in Zebrafish Behavior, Neural Activity, and c-fos Expression-Neuroscience 2005; 131(3): p. 759–768.

14.Baraban C Zebrafish as a Simple Vertebrate Organism for Epilepsy Research in // Animal Models of Epilepsy: Methods and Innovations // Editor(s): Scott C. Baraban Series: Neuromethods, 2008, Volume No. 40, p. 59–74.

15.Commission on Classification and Terminalogy of the International League Against Epilepsy, Epilepsia, 1981, v. 22, p. 489–501.

16.Dichter M.A., Overview: The neurobiology of epilepsy, in J. Engel, T.A.Pedley (eds): Epilepsy: A comprehensive Textbook, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia New Yorck 1997.

17.Dam M., Gram L.(eds.) — Comprehensive Epileptology Raven Press, New York, 1991.

18.DeLorenzo RJ, Sun DA, Blair RE, Sombati S — An in vitro model of stroke-induced epilepsy: elucidation of the roles of glutamate and calcium in the induction and maintenance of stroke-induced epileptogenesisInt.Rev Neurobiol. 2007; 81 p: 59–84.

19.Deshpande LS, Sombati S, Blair RE, Carter DS, Martin BR, DeLorenzo RJ. Cannabinoid CB1 receptor antagonists cause status epilepticus-like activity in the hippocampal neuronal culture model of acquired epilepsy. — Neurosci Lett. 2007, Jan 3; 411(1): p. 11–16.

20.Echauz Javier, Stephen Wong, Brian Litt — Seizure Analysis and Detection In vivo. — in // Animal Models of Epilepsy: Methods and Innovations // Editor(s): Scott C. Baraban Series: Neuromethods, 2008, Volume No. 40, p. 203–233.

21.Hosford D.A., Wang Y., Liu C.C., Snead O.C. Characterization of the antiabsence e ects of SCH 50911, a GABA-B receptor antagonist, in the lethargic mouse, gamma-hydroxybutirate and pentylenetetrazole models. — J. Pharmacol. Exp.Ther. — 1995. — V. 274. — №. 3. — pp. 1399–1403.

22.Goodman L.S., Swinyard E.A., Toman J.E., Laboratory technics for the identification and evaluation of potentially antiepileptic drugs — Proc. Am. Fed. Clin. Res. — 1945. — V. 2. — pp. 100–111.

23.Guerrero-Figueroa R., Barros A., Lester B. and, Heath R.-Electrophysiological Studies of Hippocampal Epileptiform Discharges During Emotional Stages. — Acta Neurol. Latinoamer. — 1966. — V. 12. — pp. 6–26.

24.Levy R.H., Mattson R.H., Meldrum B.S. (eds) — Antiepileptic Drugs, 4th ed., Raven Press, New York, 1995.

25.Loscher W., Nolting B.,- The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. IY. Protective indices. — Epilepsy Res., 1991à.— V. 8. — p. 1–10.

249