3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

Модели спинномозговой анестезии

Изучение МА при спинномозговой анестезии у крыс при хронической интратекальной катетеризации (5.6.1).

Изучение МА при спинномозговой анестезии у крыс «бескровным» методом (5.6.2).

Заключение

Методы углубленного изучения, учитывая их сложность и трудоемкость, целесообразно использовать только на конечных этапах исследования с целью уточнения основных параметров действия новых соединений.

Обязательность (или необязательность) исследования новых соединений на тех или иных моделях углубленного (целевого) изучения определяется тем конкретным видом (или видами) анестезии, при котором планируется возможное применение этих соединений в клинике. При этом для каждого выбранного вида анестезии желательно получить информацию не менее чем на 2 моделях данного вида анестезии и на разных животных.

Необходимо отметить, что любая программа исследований, выбранная авторами, должна быть составлена так, чтобы полученные данные давали наиболее полное и объективное представление о местноанестезирующей активности соединения, скорости наступления и продолжительности эффекта при различных видах анестезии, о его местнораздражающих и общетоксических свойствах и о перспективности его клинического применения как препарата.

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.

Литература

1.Анисимова В.А., Осипова М.М., Галенко-Ярошевский А.П., Пономарев В.В., Попков В.Л., Приходько А.К., Каде Е.А., Спасов А.А. Местноанестезирующая активность 1,2-дизамещен- ных имидазо[1,2-α]бензимидазолов // Химико-фармацевтический журнал. — 2002. — Т. 36. — № 8. — С. 21–24.

2.Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. — Рига. — 1959.

3.Галенко-Ярошевский А.П., Каталымов Л.Л., Шуреков В.В., Киселев А.В. Снижение рН наружного раствора замедляет скорость блокирования проводимости А-волокон седалищного нерва производным имидазобензимидазола РУ-1117// Кубанский научный медицинский вестник. — № 8. — 2009. — С. 29–33.

4.Галенко-Ярошевский А.П., Каталымов Л.Л., Шуреков В.В., Киселев А.В. Снижение рН наружного раствора ослабляет блокирование проводимости А-волокон седалищного нерва производным имидазобензимидазола РУ-353// Кубанский научный медицинский вестник. — № 8. — 2009. — С. 33–36.

5.Галенко-Ярошевский А.П., Шейх-Заде Ю.Р., Чередник И.Л. Сравнительная оценка проводниковой анестезии, получаемой с помощью новокаина, маркаина и вещества РУ-353 // Бюл. эксперим. биол. и мед. — 2005. — Т. 139. — №6. — С. 645–646.

6.Игнатов Ю.Д., Васильев Ю.Н., Шальнова Л.И. и др. Местноанестезирующие свойства полимерного соединения тримекаина // Бюл. экспер. биол. и мед. — 1986. — № 6. — С. 686–688.

7.Каталымов Л.Л., Голенко-Ярошевский А.П. Изменение следовой деполяризации изолированного нерва при выдерживании его в растворе Рингера. — Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — Приложение 3. — 2007. — С. 25–29.

8.Мангушева Н.А., Каталымов Л.Л. Особенности блокирования проведения возбуждения в нерве аймалином и лидокаином. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2007. — Т. 3. — С. 262–266.

361

ГЛАВА 21

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ ГИПОТЕНЗИВНОЙ АКТИВНОСТИ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: академик РАМН В.И. Петров; д. м. н. проф. О.С. Медведев; член-корр. РАМН, проф. И.Н. Тюренков; д. б. н., проф. А.Н. Мурашев

Введение

Артериальная гипертония (АГ) как в Российской Федерации, так и во всех странах с развитой экономикой является наиболее распространенной сердечно-сосудистой патологией, приводящей к тяжелым осложнениям: мозговым инсультам, развитию почечной и сердечной недостаточности, прогрессированию атеросклероза и, в конечном счете, к преждевременной инвалидизации и смертности.

Достижение целевого уровня артериального давления является основной задачей лекарственной терапии АГ это доказано в значительном ряде крупных, многоцентровых исследований и реальным увеличением продолжительности жизни в Западной Европе и Северной Америке.

В настоящее время для лечения артериальной гипертензии существует множество ЛС различных классов, которые могут влиять на различные патогенетические механизмы регуляции сосудистого тонуса и АД, способные при моноили комбинированной терапии достигать «целевого» АД. В связи с расширением спектра антигипертензивных средств, появлением новых инновационных препаратов с оригинальным механизмом действия, с одной стороны, повышаются возможности эффективной фармакотерапии АГ, обеспечивающие проведение персонифицированного лечения, с другой — повышаются требования к новым разрабатываемым инновационным средствам лечения гипертонической болезни, и увеличивается объем доклинических исследований специфической активности.

1. Общие положения

Клиническая медицина требует широкого арсенала гипотензивных препаратов, которые обладали бы оригинальными механизмами действия, высокой эффективностью, минимальными побочными эффектами. Антигипертензивный препарат может быть рекомендован для длительной терапии или для купирования острых гипертензивных состояний, если он отвечает ряду требований:

1.При умеренной гипертонии ЛС способствует достижению целевого давления.

2.Антигипертензивное действие должно развиваться постепенно, но стабильно и длительно при однократном суточном приеме, при этом не вызывать ортостатическую гипотонию, не нарушать адаптационных реакций ССС.

3.Не вызывать привыкания и синдрома отмены после прекращения приема препарата, т. е. не давать вторичного гипертензивного эффекта.

4.Улучшать или не ухудшать кровоснабжение жизненно важных органов, положительно влиять на органы-мишени.

5.Не вызывать тахикардию, не ухудшать функциональные резервы сердца (не нарушать процессов срочной и долговременной адаптации сердца к повышенной нагрузке), вызывать обратное развитие гипертрофированного миокарда.

6.Улучшать эндотелиальную функцию (ЭФ).

7.Быть мало токсичным, не ухудшать качество жизни (не снижать умственную, физическую работоспособность, сексуальные потенции), иметь большую широту терапевтического действия.

363

8.Не нарушать жировой, углеводный и водно-солевой обмен, т.е. препарат должен быть метаболически нейтральным.

9.Снижать риск развития сердечно-сосудистых осложнений, улучшать прогноз.

10.Быть относительно дешевым и удобным в употреблении.

Для купирования острых гипертензивных состояний (гипертонических кризов) лекарственный препарат должен:

1.Обладать высокой антигипертензивной активностью, специфичностью действия на сердечно-сосудистую систему.

2.Приводить к быстрому, но нерезкому снижению системного АД. Оказывать кратковременное гипотензивное действие.

3.Не вызывать тахифилаксии.

4.Не нарушать кровоснабжение жизненно важных органов, не оказывать кардиотоксического действия.

На этапе доклинических исследований гипотензивной активности новых веществ трудно в полной мере ответить на вопрос: а в какой мере новое разрабатываемое лекарственное вещество будет отвечать выше обозначенным требованиям? Однако в ходе доклинического исследования разработчик должен постараться в максимальной степени изучить фармакодинамику и фармакокинетику вещества — для того, чтобы обозначить особенности его кардиоваскулярного действия, дополнительные полезные эффекты и определить, имеющиеся преимущества перед уже применяющимися ЛС для лечения гипертонической болезни и близкими к нему по механизму действия препаратами.

2. Основные этапы доклинических исследований 1-й ЭТАП — скрининг. Задача — из определенного числа близких по структуре соеди-

нений выявить и отобрать вещество с выраженным гипо- и анитигипертензивным действием, определить зависимость доза–эффект, его острую токсичность и широту терапевтического действия в сопоставлении с препаратом сравнения (эталоном).

2-й ЭТАП — углубленное изучение особенностей и возможного механизма гипотензивного действия фармакологических средств (ФС)

Основные задачи:

1.Изучить влияние ФС на базовые показатели центральной гемодинамики.

2.Исследовать возможный механизм гипотензивного действия (симпатикотропное центральное и периферическое) и влияние на активность ренин-ангиотензин- альдестероновой системы, миотропное действие.

3.Изучить эндотелиотропные эффекты вещества.

4.Изучить метаболические эффекты исследуемого вещества.

Дополнительные задачи:

1.Изучить влияние ФС на тонус резистивных и емкостных сосудов и приток крови

ксердцу.

2.Изучение влияния на буферные сосудистые рефлексы в норме и в условиях эмоционально-болевого воздействия.

3.При выявлении возможного влияния на психо-эмоциональную и когнитивную функцию (процессы поведения, обучения, памяти) расширить изучение спектра психотропных эффектов.

4.При наличии эндотелиотропного действия расширить изучение влияния вещества на другие функции эндотелия (пролиферативную, воспалительную).

5.Изучить влияние вещества на агрегацию свертываемость крови.

2.1. Скрининг

Проведение скрининга и углубленного изучения веществ с антигипертензивным действием может проводиться с учетом технических возможностей лаборатории, обученности исследователей, их предпочтений в выборе средств и путей достижения по-

364

ставленной цели — это создание оригинального, высокоэффективного и малотоксичного препарата.

Скрининг веществ с гипо- и антигипертензивным действием необходимо выполнить на нескольких видах экспериментальных животных (крысах, кошках, кроликах и др.), нормо- и гипертензивных, наркотизированных и бодрствующих животных, при однократном и курсовом введении.

Для начала необходимо решить первую задачу и ответить на вопрос: обладает ли ФС гипотензивной активностью, будучи взятым в стандартной, заведомо большой дозе.

Для этого выполняются две серии по 3–4 исследования. Регистрацию АД можно осуществлять неинвазивным и инвазивным методами. Неинвазивным методом можно регистрировать АД с хвоста крысы с помощью фотоплетизмографического или сфигмоманометрического датчика и монитора давления и использованием компьютерных пакетов программ. Для этого первоначально в течение 10 дней необходимо приучить крыс к введению препарата через рот, помещению их в пенал для ограничения их движений во время измерения АД и манипуляциям, связанным с измерением АД с хвоста крысы. О приученности судим по отсутствию сопротивления и возбуждения при помещении животных в пенал и по стабильным показателям АД измеряемым этим методом. Такой подход позволяет длительно использовать экспериментальных животных, повторяя введение одной дозы, уменьшая или увеличивая ее.

Впервой серии исследований ФС вводится внутрь в дозе 1/10 от молекулярной массы вещества, но не более 50 мг/кг норматензивным, а при возможности спонтанногипертензивным крысам (SHR).

При регистрации АД инвазивным способом предварительно животным вживляется полиэтиленовый катетер в бедренную или сонную артерию для прямой регистрации АД.

Втечение 6–24 ч после введения вещества регистрируются АД и частота сердцебиений. Для проведения эксперимента требуются электроманометр с малым объемным смещением (не более 0,01 мл/100 мм рт.ст.), кардиотахометр, запускаемый пульсовой волной АД и двухканальный регистратор. ФС подвергается дальнейшему изучению, если под его влиянием АД понижается на 15–25 мм рт. ст. или более на период 2 ч или более. Если вещество первоначально снизило АД незначительно, но продолжительно, можно повторить измерение АД на следующий день и повторно ввести исследуемое вещество и регистрацию продолжить в течение нескольких часов. Если при повторных введениях вещества животным с экспериментальной гипертензией антигипертензивный эффект возрастает и стабильно (длительно) сохраняется сниженным, целесообразно продолжить его изучение. При обнаружении гипо-, антигипертензивного эффекта целесообразно изучить зависимость доза–эффект. Для этого животным вводится вещество в дозе в 2 раза меньше первоначальной, и если эффект выраженный или незначительно уступает предыдущему, дозу можно еще раз уменьшить в 2–5 раз. Такой подход позволит рассчитать ЭД20, т.е. дозу, снижающую АД на 20%.

Висследованиях второй серии (3–4 эксперимента) ФС вводится в дозе 5 мг/кг внутривенно наркотизированным нормотензивным крысам. У животных измеряются АД и частота сердцебиений. В связи с отсутствием гипотензивного эффекта у нормотензивных животных при однократном введении бета-адреноблокаторов и ингибиторов ангиотензин-конвертирующего фермента протокол исследования включает введение стандартной дозы изадрина и ангиотензина-II до и после введения исследуемого вещества. ФС подвергается дальнейшему изучению, если оно приводит к снижению АД на 15–25 мм рт.ст. и более или угнетает эффекты изадрина или ангиотензина-II, даже в случае отсутствия заметного влияния на АД.

Далее необходимо определить ЛД50, лучше при двух путях введения (пероральном и внутрибрюшинном) и на двух видах животных (мышах и крысах), что позволит рас-

считать терапевтический индекс. Подробное описание методов расчетов ЛД50 приведено в данном руководстве.

365

После этого необходимо определить видовую чувствительность экспериментальных животных к сосудистому действию ФС.

Исследования проводятся на двух–трех видах животных: крысы, кошки, кролики, собаки, морские свинки и др. (желательно два вида грызунов и один вид животных, не относящихся к грызунам) при введении веществ, обладающих отчетливой гипотензивной активностью. ФС вводится в эффективной дозе (ранее определена при изучении зависимости доза–эффект) 3–4 животным. Одинаково выраженное гипотензивное действие ФС в исследованиях на животных разных видов повышает вероятность перенесения экспериментальных данных по гипотензивной активности ФС на человека.

Животное во время исследования обогревается, чтобы температура тела его была в пределах 37–38 °С. В каждой лаборатории должны быть подобраны стандартные дозы тестирующих препаратов (агонистов и антагонистов различных рецепторов).

Предлагаемая схема скрининга эксперимента позволяет получить данные о наличии гипотензивной активности ФС, определить ЭД20, т. е. дозу, снижающую АД на 20%, рассчитать терапевтический индекс (ТИ):

Если скрининг осуществляется среди соединений одного химического ряда, близких по структуре препарату с известным рецепторным механизмом гипотензивного действия, он может проводиться in vitro. In vitro исследование выполняется на изолированных сосудах (берется кольцо или спираль артериальных или венозных сосудов, лучше первые) или изолированном сердце или его фрагменте (предсердие, трабекулы миокарда, папиллярные мышцы) с регистрацией их сокращения под влиянием изучаемых соединений в различных концентрациях. Вещество может не оказывать прямого действия на тонус сосудов или на работу сердца, в этом случае следует провести исследование, используя различные агонисты и антогонисты. Таким образом можно выявить возможное альфа- и бета-адреноблокирующее действие, а также дофамино-, М-холино-, серотонино-, ангиотензинергическое действие.

На основании данных, полученных in vitro, можно провести сравнение активности исследуемых веществ по IC20 или IC50. После этого необходимо с наиболее активным соединением провести исследование in vivo, как это описано выше.

Количественную оценку гипотензивной активности ФС (ЭД20) рекомендуется проводить в исследованиях на крысах с таким типом экспериментальной гипертонии, которая наиболее чувствительна к действию соединений с данным механизмом действия. Так, например, при изучении новых ингибиторов ангиотензин-конвертирующего фермента желательно проводить эксперименты на крысах с двухпочечной моделью гипертонии (удаление одной почечной артерии и выведение другой под кожу спины животного с последующим тугим ушиванием мышц под почкой). У таких животных вследствие ишемии оставшейся почки в первые недели развития гипертонии повышена активность ренин-ангиотензиновой системы. Большинство других соединений с гипотензивной активностью может быть изучено на спонтанно-гипертензивных крысах и крысах с ДОКАсолевой гипертонией.

На основании экспериментов на этапе скрининга экспериментатор имеет возможность сравнить новое ФС и адекватно выбранный препарат сравнения по силе и длительности гипотензивного действия, по терапевтической широте, частично получить предварительные представления о возможных побочных эффектах и т. д.

Данные, полученные на этапе скрининга, пока лишь позволяют сделать вывод о перспективности его дальнейшего углубленного изучения, т.к. выраженность и продолжительность гипотензивного действия еще недостаточно для определения преимуществ перед известными препаратами и окончательного решения о разработке на его основе ЛС. Это вещество при равных кардиоваскулярных свойствах должно иметь определенные

366

преимущества перед существующими средствами, близкими по механизму действия, по другим дополнительным (плейотропным) свойствам.

Существенными положительными свойствами нового вещества могут быть:

—благоприятный гемодинамический механизм гипотензивного действия (умеренное увеличение сердечного выброса на фоне снижения сосудистого сопротивления и частоты сердечных сокращений);

—улучшение кровоснабжения сердца, мозга, почек;

—улучшение углеводного, жирового, водно-солевого обмена;

—улучшение вазодилатирующей, антитромботической, антипролиферативной, противовосполительной функции эндотелия;

—улучшение психоэмоционального состояния (положительное влияние на тревож- но-депрессивную симптоматику) и когнитивной функции.

Результаты второго этапа исследований должны дать ответ на вопрос: имеет ли новое соединение преимущества перед уже известным и используемым в клинике препаратом со сходным механизмом действия.

2.2.Углубленное изучение особенностей

имеханизма действия нового фармакологического средства

На втором этапе исследований необходимо получить ответы на несколько принципиальных вопросов:

1.Каков гемодинамический механизм гипо-антигипертензивного действия данного вещества, т.е. влияние на основные показатели гемодинамики: минутный объем крови, общее сосудистое сопротивление, частоту сердечных сокращений, сократимость миокарда.

2.Влияние вещества на кровоснабжение жизненоважных органов (сердца, мозга, почек).

3.Учитывая значительную роль в развитии гипертензии эндотелиального фактора и роль эндотелиальной дисфункции в развитии сердечно-сосудистых осложнений — необходимо изучить влияние вещества на эндотелиальную функцию (ограничившись определением ее вазодилатирующей и антитромботической функций).

4.Определить ориентировочный нейро-гуморальный механизм гипотензивного дей-

ствия:

— наличие центрального или периферического симпатотропного действия;

— взаимодействие вещества с альфа- и бета-адренорецепторами, серотониновыми, М-холинорецепторами и др.;

— возможное влияние на ренин-ангиотензин-альдостероновую систему и уровень катехоламинов в плазме крови;

— миотропное действие.

Предварительные данные о механизме гипотензивного действия ФС позволят обоснованно подойти к выбору препарата сравнения из большого набора применяемых в клинике антигипертензивных препаратов.

2.2.1. Изучение влияния ФС на основные показатели центральной гемодинамики

Экспериментальные животные — крысы 180–350 г, кошки 2–4 кг, кролики 2,5–4 кг, собаки 8–15 кг. Наркоз — нембутал 50 мг/кг или уретан с хлоралозой соответственно 600 и 40 мг/кг. САД измеряется электроманометром или ртутным манометром Людвига в общей сонной артерии или в бедренной артерии.

Минутный объем крови (МОК) определяется методом электромагнитной, ультразвуковой флоуметрии, термодилюции или тетраполярной реографии.

Электромагнитная и ультразвуковая флоуметрия требует соответствующего оснащения, перехода животного на искусственное дыхание и сложных хирургических манипуляций — вскрытие грудной клетки, выделение восходящей части аорты, наложение датчика на нее и др. Достоинством этого метода определения МОК является:

367

а) возможность непрерывного наблюдения за динамикой сердечного выброса; б) возможность регистрации первой производной сигнала кровотока в аорте, по кото-

рой можно судить о контрактильности левого желудочка.

Для регистрации МОК пригоден старый, но хорошо апробированный метод термодилюции, который подробно описан в литературе, и дающий достоверные данные о величине сердечного выброса. Недостатком метода является дискретность определения показателей МОК.

Для определения ударного выброса и минутного объема крови может с определенным успехом использовать метод тетраполярной реографии, если экспериментатор овладел, а запись и расчет всех показателей производится автоматически с помощью специального пакета компьютерных программ.

Входе исследования может регистрироваться ЭКГ. Величина общего периферического сопротивления (лучше рассчитывать удельное периферическое сопротивление) оценивается по формуле:

Вфармакологическом эксперименте нас интересует не абсолютная величина показателей кровообращения, а их динамика после введения исследуемого препарата по сравнению с исходными величинами.

Эти исследования имеют важное значение для понимания гемодинамического механизма гипотензивного действия препарата, для прогноза его возможного дальнейшего применения в клинической практике и определения более рациональных путей к дальнейшему его углубленному изучению.

2.2.2. Изучение влияния ФС на кровоснабжение жизненноважных органов: мозг, сердце, почки

В исследованиях данной серии важно оценить влияние ФС на объемную скорость кровотока в жизненно важных органах. Для этого необходимо использовать любой из методов определения кровотока — ультразвуковую или электромагнитную флоуметрию, капельные измерители венозного оттока (методы подробно описаны в других главах настоящего руководства).

Одним из наиболее удобных и информативных является метод с использованием меченых изотопами микросфер [12], позволяющий определить объемную скорость кровотока в любом органе или ткани.

О влиянии нового вещества на коронарное кровообращение, функциональное состояние очага ишемии можно судить по изменению сегмента ST на множественных ЭКГ сердца, записанных в норме и при временной ишемии миокарда до и после введения исследуемого вещества.

2.2.3.Оценка центрального и периферического симпатикотропного компонента

вмеханизме гипотензивного действия ФС

Для оценки центрального компонента в действии ФС могут быть использованы как достаточно простые так и сложные методы с использованием оборудования, позволяющего регистрировать фоновую и вызванную активность в пре- и постганглионарных волокнах, например почечном и нижнесердечном нервах. К простым методам можно отнести изучение изменений АД под влиянием вещества у спинальных животных или животных с разрушенным мозгом. Электрическая стимуляция преганглионарных симпатических волокон у животных с разрушенным мозгом осуществляется с помощью спицы из нержавеющей стали, вставленной в спинномозговой канал. Неизолированный участок спицы-электрода может быть установлен на любом уровне канала для избирательной стимуляции сосудистых (уровень нижних грудных и верхних поясничных сегментов) или сердечных (уровень верхних грудных сегментов) симпатических волокон. Отсутствие влияния изучаемого ФС на фоновый уровень давления

368

и прессорные реакции, вызванные электрической стимуляцией, у животных с разрушенным мозгом позволяет думать о центральном механизме гипотензивного действия. Убедительные данные о наличии или отсутствии центрального гипотензивного действия вещества могут быть получены в исследованиях с введением соединения внутривенно и в позвоночную артерию. Если одинаковое снижение АД может быть вызвано введением в десятки раз меньшей дозы ФС внутриартериально по сравнению с дозой, вводимой внутривенно, то это говорит о наличии центрального механизма в развитии гипотензивного эффекта.

Центральное симпатоингибирующее действие можно исследовать в условиях стимуляции седалищного нерва и регистрации изменений АД до и после введения исследуемого вещества (с помощью ртутного, электроманометра на мехатронах, тензодатчиках и др.; в этих случаях жесткие требования к измерителям АД, но желателен небольшой объем смещения). Исследования выполняются на наркотизированных крысах и кошках.

Параметры стимуляции седалищного нерва подбираются произвольно, ориентируясь на величину подъема системного АД (обычно 30–35 мм. рт. ст.). Сравнивая степень прессорной реакции до и после введения исследуемого вещества мы можем судить (при исключении периферического ганглионарного, симпато- и адренолитического действия) о центральном симпатоингибирующем действии.

Например: Подъем АД при стимуляции седалищного нерва до введения исследуемого вещества в среднем равнялся 1=32 мм.рт.ст., а после введения 2= 8 мм.рт.ст., тогда симпатоингибирующее действие (СИ) можно вычислить по формуле:

где 1 и 2 — степень повышения АД до (Δ1) и после (Δ2) введения вещества.

В данном случае подавление прессорных реакций на 75% зависит от симпатоингибирующего действия. Изучение ганглионарного действия описано выше.

Если лаборатория располагает приборами, регистрирующими кровоток (ультразвуковые, электромагнитные расходомеры), можно выполнить исследование с регистрацией кровотока в бедренной артерии или мышце бедра при стимуляции поясничной симпатической цепочки ниже уровня L4.

При раздражении поясничной цепочки, пересеченной выше места стимуляции, наблюдается сужение сосудов и падение кровотока в бедренной артерии или мыщце бедра. Сравнивая эффект до и после введения исследуемого вещества, можно заключить о наличии ганглионарного действия. Например: до введения вещества в ответ на стимуляцию поясничной симпатической цепочки кровоток снизился на 30%, и после введения при тех же параметрах стимуляции кровоток снизился на 32%. Можно заключить, что вещество не оказывает ганглионарное, симпато- и адренолитическое действие, а подавление прессорных реакций АД, вызванных раздражением седалищного нерва, обусловлено центральным симпатоингибирующим действием.

Если вещество уменьшает падение кровотока при раздражении поясничной симпатической цепочки, но не меняет прессорные реакции на введение тирамина и норадреналина, то это свидетельствует о его ганлионарном действии.

2.2.4.Оценка влияния ФС на эндотелиальную функцию, липидный, углеводный и водно-солевой обмен

Такая оценка является важным моментом в характеристике нового химического вещества с антигипертензивным действием. Учитывая частую комбинацию ГБ с сахарным диабетом (СД) или метаболическим синдромом (МС) данные о положительном или негативном влиянии на указанные виды обмена веществ приобретают принципиальное значение и могут либо повысить шансы занятия достойного места в лечении ГБ, либо наоборот, значительно ограничить их клиническое применение в будущем.

369

Результаты проспективных исследований свидетельствуют, что эндотелиальная дисфункция (ЭДФ) всегда сопутствует ГБ и является прогностическим фактором риска сердечно-сосудистых осложнений и смертности. Поэтому любое лечение сердечнососудистых заболеваний должно учитывать влияние терапии на ЭФ/ЭДФ, а при терапии ГБ задачей является не только нормализация АД, но и нормализация ЭФ.

Для изучения влияния веществ одновременно на углеводный, жировой, водносолевой обмен веществ, а также на эндотелиальную функцию приемлемой моделью может служить экспериментальный СД, индуцированный стрептозотоцином или аллоксоном. В этом случае при моделирование СД на крысах (могут использоваться и беспородные животные, и крысы линии Вистар), зрелого возраста (8–12 мес. и более) и массой 280–350 г. Уже через неделю после введения стрептозотоцина в дозе 40–50 мг/кг отмечается значительное повышение сахара в крови (в дальнейшем в работу отбираются животные с уровнем сахара в крови выше 12–15 ммоль/л), а также ЛПНП, атерогенного коэффицента, развитие эндотелиальной дисфункции, практически всегда микроальбуминурии.

Через 10–15 дней проведенного курсового лечения можно определить влияние соединений на обмен веществ, на потребление пищи и воды, оценить основные функции эндотелия (вазодилатирующую, антитромботическую, пролиферативную, противовоспалительную).

Для оценки влияния вещества на ЭФ могут использоваться различные методы: инвазивные и неинвазивные, биохимические, функциональные, морфологические, выбор которых зависит от поставленных задач и имеющегося оборудования, обученности персонала, его приверженности к методам исследования.

Биохимическими маркерами ЭДФ являются:

—оксид азота (его метаболиты — нитриты, нитраты);

—эндотелиальная NO-синтаза;

—эндотелин-1;

—фактор Виллебранда;

—С-реактивный белок и др.

Разрабатываемая методическая стратегия изучения ЭДФ базируется на определении маркеров, вырабатываемых эндотелием или их метаболитов, или изучение их эффектов. ЭДФ в первую очередь проявляется нарушением продукции NO. Оксид азота является мощным вазодилататором и модулятором выработки других активных веществ в эндотелии, играет ключевую роль в кардиоваскулярном гемостазе, ингибируя адгезию и агрегацию циркулирующих тромбоцитов, предотвращая пролиферацию клеток гладких мышц сосудов и др. В тоже время признается, что именно NO-продуцирующая функция эндотелия оказывается наиболее ранимой системой.

NO имеет короткий период жизни (от 6 до 30 с), поэтому определяются его метаболиты — нитриты и нитраты. Определение метаболитов NO требует тщательной подготовки больного или животного, забора крови в 8–9 ч, когда отмечается базальная концентрация NO. Однако изучение одних метаболитов оксида азота вряд ли позволит получить полную информацию о состоянии NO-продуцирующих систем, поэтому объективным и наиболее реальным способом оценки состояния эндотелия in vivo является определение эндотелий-зависимой вазодилатации (ЭЗВД) при инфузии ацетилхолина, серотонина, брадикинина.

Вазодилатирующую функцию эндотелия можно оценить в эксперименте с регистрацией кровотока в определенной сосудистой области (сосудах конечности, мозга, почки и др.) при введении ацетилхолина. Сравнивая ЭЗВД у животных контрольной (интактной) группы и контрольной группы животных с экспериментальным СД, можем заключить о выраженности ЭДФ по разнице вазодилатации у животных этих групп.

Например, введение ацетилхолина интактным животным вызывает увеличение кровотока на 40%, у животных с экспериментальным СД на 12%, а у животных с СД, полу-

370