3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

средства — в приведенном случае 2 мМ Б — то же после 7-минутного выдерживания нерва в

ществом и измеряют амплитуду максимального одиночного ПД. Когда его амплитуда снизится до 50% от исходной величины, снова производится регистрирация ПД нерва, возникающих на одиночные и ритмические максимальные стимулы (рис 2).

После этого нерв помещают в раствор Рингера для определения времени, в течение которого произойдет отмывание из него анестезирующего вещества, о чем судят

351

по устранению тонического, а затем и стимул-зависимого блокирования проводимости нервных волокон. Для этого нерв периодически вынимают из раствора Рингера, укладывают на электроды экспериментальной камеры и регистрируют амплитуду одиночного максимального ПД нерва. Эту процедуру продолжают вплоть до полного восстановления исходной амплитуды ПД на максимальное раздражение. Промежуток времени от начала отмывания нерва до полного восстановления его исходной амплитуды получило название время (продолжительности) устранения тонического блокирования. Аналогично, по прекращению снижения амплитуды ПД в процессе 1-секундной ритмической стимуляции определяется время устранения стимул-зависимого блокирования проводимости нерва, которое обычно продолжительнее времени устранения тонического блокирования.

Дополнительно результаты исследований могут быть оформлены в виде графика измения амплитуды ПД в процессе действия анестезирующего вещества и его последующего отмывания.

5.4.Комбинированные модели анестезии

5.4.1.Комбинированное (одновременное) выявление местноанестезирующей активности при инфильтрационной

ипроводниковой анестезии у мышей методом лучевой анальгезиметрии

Исследования выполняют на мышах-самцах массой 18–20 г, у которых оценивают

латентный период отведения хвоста при термическом воздействии фокусированного луча света. Методика проведения исследования аналогична описанной для крыс за исключением того, что при отборе животных наведение луча света осуществляют дважды в последовательности дистальный — проксимальный участки хвоста с интервалом 10 с и получают таким образом фоновые значения латентных периодов в пределах от 3 до 5 с иглы диаметром 0,3 мм под кожу в ростральном направлении в дорсальную поверхность проксимального участка хвоста на расстоянии 1 см от его корня. Для точного дозирования объема вещества используют шприц с микровинтом, соединенный с иглой с помощью полиэтиленового катетера.

В процессе повторного тестирования термическое воздействие наносят дважды в той же последовательности, что и при контрольном тестировании: сначала на дистальный участок (1 см от кончика хвоста), затем — на проксимальный его участок (в область инфильтрирования раствором изучаемого вещества — 1 см от корня хвоста). В первом случае оценивают значения латентных периодов реакций для проводниковой анестезии (П), во втором — для инфильтрационной анестезии (И). Оценку МА новых соединений осуществляют в соответствии с критериями, описанными для метода на крысах (6.3.9.).

Используя метод двойного наведения луча на хвост мышей, можно получить дополнительную информацию о глубине и длительности МА в условиях, когда тепловое воздействие наносится в течение более длительного времени, ограниченного повреждением тканей хвоста. В этом случае схема эксперимента должна быть изменена. Отобранных по результатам фонового тестирования животных группируют (по 6 мышей) для каждого заданного интервала времени между моментом введения МС и моментом последующего тестирования, которое осуществляют у каждой группы один раз (независимые выборки). Тестирование контрольной группы животных производят в соответствии со временем тестирования получавших ЛС групп: через 5, 15, 30, 60, 90 мин и т.д. Полученные данные обрабатывают статистически, учитывая значения латентных периодов реакции отведения хвоста по каждой группе животных отдельно по результатам стимуляции дистального (М ± m) и (М1 ± m) и, соответственно, проксимального (М2 ± m) участков хвоста. Затем сопоставляют указанные значения с соответствующими значениями латентных периодов в контрольной группе животных, используя t-критерий Стьюдента. Полученные результаты сводят в таблицу, рассчитывают коэффициенты (К), характе-

352

ризующие глубину местноанестезирующего действия соединения в каждый из изучаемых временных интервалов между введением вещества и моментом тестирования его эффекта. Коэффициент К представляет собой отношение среднего значения латентных периодов отведения хвоста после введения изучаемого вещества к среднему значению латентных периодов отведения хвоста в контрольной группе животных. В качестве примера см. табл. 12.

При проведении исследований по методикам 6.3.9 и 6.4.1 необходимо соблюдать оптимальный температурный режим в экспериментальной комнате (не менее 20 ˚С), так как при охлаждении животного ухудшается гемодинамика в области хвоста и увеличивается вероятность появления ошибочных данных.

Таблица 12

Местноанестезирующая активность тримекаина и бупивакаина (маркаина) при инфильтрационной и проводниковой анестезии у мышей

Примечание. Представлены данные из 6 исследований для каждой временной характеристики.

5.5.Модели эпидуральной анестезии

5.5.1.Изучение местноанестезирующей активности

укроликов при эпидуральной анестезии через дужку позвонка

Исследования проводят на кроликах-самцах массой 2,8–3,6 кг. Под местной анесте-

зией (прокаин — 0,5% раствор) осуществляют доступ к дужке поясничного позвонка на уровне гребней подвздошных костей. С помощью зубного бора диаметром около 1,5 мм в дужке позвонка осторожно высверливают отверстие, достигая твердой мозговой оболочки. Через это отверстие на глубину 1,5 см аккуратно, не перфорируя твердую мозговую оболочку, в ростральном направлении вводят полиэтиленовый катетер диаметром около 1,4 мм, который используют для введения изучаемого вещества в перидуральное пространство. Перед введением вещества оценивают исходный порог болевой реакции в ответ на электростимуляцию задней конечности кролика через внутрикожные игольчатые электроды. Используют прямоугольные импульсы тока частотой 100 Гц, длительностью 1 мс, напряжением от 1 В и выше, продолжительность каждого стимула 2–3 с. Болевые пороги определяют по дыхательной (см. раздел 6.2.2) и двигательной реакциям, а также по вокализации животных. Раствор изучаемого вещества в нужной концентрации вводят через катетер в объеме 1 мл и по изменениям болевых порогов определяют начало, глубину и продолжительность местной анестезии. Сопоставляют результаты, полученные в группах сравнения (у животных при эпидуральном введении изотонического раствора натрия хлорида, у животных при эпидуральном введении эталонного местного анестетика) с результатами, полученными в получавшей ЛС группе (у животных при эпидуральном введении изучаемого вещества). Статистическую обработку проводят с помощью непараметрического метода. Результаты исследований заносят в таблицу (см. табл. 13).

353

5.5.2.Изучение местноанестезирующей активности

укроликов при эпидуральной анестезии через межостистую связку

Кролика-самца массой 2,8–3,0 кг фиксируют в положении на животе за лапы на стан-

ке. Определяют порог болевой чувствительности животного, используя электростимуляцию одной из задних лап. Раздражение наносят током частотой 50 Гц, длительностью 1 мс с помощью внутрикожных электродов от стимулятора. Показателем болевой реакции является изменение ритма и амплитуды дыхания животного. Регистрацию дыхания осуществляют на самописце (см. раздел 6.2.2.).

На спине кролика определяют месторасположение гребня подвздошных костей. На этом уровне по ходу позвоночника освобождают кожу от шерсти. Анестезию проводят «бескровным» методом. Пункцию эпидурального пространства осуществляют детской иглой для спинномозговой анестезии после анестезии кожи 0,2 мл 0,25% раствором новокаина на один сегмент выше подвздошных костей. Иглу с мандреном вводят в межостистые связки по центру позвоночника под углом 3–45° краниально. Мандрен удаляют и подсоединяют шприц с изотоническим раствором натрия хлорида. Осторожно продвигают поршень и иглу в перидуральное пространство.

Критериями попадания в перидуральное пространство служат тест утери сопротивления и характерное вздрагивание кролика на введение иглы. Далее через иглу вводят медленно за 20–30 с 1 мл раствора изучаемого вещества, после чего иглу удаляют. Вместе с тем точность введения в эпидуральное пространство таким способом требует хорошего навыка.

Тестирование болевой реакции животного в ответ на стимуляцию задней конечности осуществляют непосредственно после введения вещества, через 3, 5, 15, 30 мин и далее через каждые 30 мин. О времени наступления анестезии, ее глубине и длительности судят по изменению показателя болевого порога животного. Глубину анестезии выражают в процентах. Повышение порога по сравнению с исходным значением на 2 В принимают за 40% анестезию, на 5 В — за 100% и расценивают как полный эпидуральный блок. Результаты исследований заносят в таблицу (табл. 14).

Примечание. Представлены средние данные из 5 исследований со стандартной ошибкой средней.

354

5.6.Модели спинномозговой анестезии

5.6.1.Изучение местноанестезирующей активности при спинномозговой анестезии у крыс

по методу хронической интратекальной катетеризации

Исследования проводят на крысах массой 200–250 г в условиях свободного поведения животных. Предварительно под нембуталовым наркозом крысам вводят полиэтиленовый катетер под твердую оболочку спинного мозга. С этой целью поверхность кожи на уровне IV–V поясничных позвонков тщательно выбривают. Разрезают кожу и фасции, раздвигают мышцы и инъекционной иглой делают отверстие в твердой мозговой оболочке спинного мозга. Катетер диаметром 0,5–1 мм и объемом 5 мкл осторожно вводят через это отверстие и продвигают вверх на 2–3 сегмента. Свободный конец катетера фиксируют к мышцам во время послойного зашивания раны. Эксперименты на животных проводят на 3–4-й день после операционной подготовки. Болевую чувствительность животных оценивают в тесте отведения хвоста (tail-flick) и/или по порогу вокализации при механическом раздражении корня хвоста. Одновременно можно регистрировать реакции артериального давления в сонной артерии и частоту дыхания. Раствор изучаемого вещества вводят с помощью микрошприца типа МШ-М 1. Через выбранные промежутки времени осуществляют повторные определения болевой чувствительности животных, которые сопоставляют с контрольными значениями.

5.6.2. Изучение местноанестезирующей активности при спинальной анестезии у крыс «бескровным» методом

Исследования проводят на крысах-самцах массой 200–250 г. На уровне поясничного отдела позвоночника крысы ножницами отсекают предварительно анестезированный (1–2 мл 2% раствора новокаина) участок кожи диаметром 2 см. В результате обнажаются структуры костно-мышечного аппарата поясничной области, позволяющие обнаружить локализацию остистых отростков позвоночника и связок между ними, которые являются основными ориентирами для направленного погружения инъекционной иглы до уровня спинномозгового канала. Используя тесты отведения лапы и отведения хвоста при электростимуляции лапы, термическом и механическом раздражении корня хвоста, определяют пороги болевой чувствительности животных до введения вещества. Подведение вещества крысам осуществляют с помощью шприца, оснащенного дозирующим микровинтом и соединенного при помощи полиэтиленового капилляра с инъекционной иглой. Для проведения исследования используют инъекционную иглу диаметром 350 мк с измененным углом заточки 45°. Игла вкалывается строго по сагиттальной плоскости каудально, под углом около 50° к линии позвоночного столба, в области связки между остистыми отростками III и IV поясничных позвонков, на глубину до ощущения легкого «провала» иглы. Сразу после этой процедуры приступают к медленному введению раствора изучаемого вещества (объем 40 мкл) в спинномозговой канал крысы с помощью микроинъектора (точность подведения вещества к спинному мозгу требует хорошего навыка). Критерием попадания активного вещества к спинному мозгу является определяемый визуально паралич задних конечностей животного.

В этих условиях приступают к последовательному тестированию болевой чувствительности животных. В первые 15 мин после введения изучаемого вещества определяют изменение болевой чувствительности крыс через каждые 5 мин и далее через каждые 15 мин до восстановления фоновых значений, зарегистрированных непосредственно перед началом эксперимента. На основании изменений болевых порогов животных после введения исследуемого вещества определяют время наступления, глубину и продолжительность анестезии. Увеличение болевого порога в 5 раз при электрическом раздра-

355

жении лапы или механическом раздражении корня хвоста, а также увеличение порога болевой чувствительности на 10 с при термическом раздражении хвоста животного принимают за 100% анестезию. С каждой концентрацией раствора изучаемого вещества ставят 6 исследований. Контрольным крысам вводят изотонический раствор натрия хлорида (или другой растворитель, используемый для исследуемого вещества) таким же способом, как и получающим ЛС крысам. Результаты исследований сводят в таблицу. В качестве примера см. табл. 15.

Примечание. Представлены средние данные из 6 исследований со стандартной ошибкой средней.

6. Методики изучения местнораздражающего действия местных анестетиков

Перспективным для клинического применения могут считаться только те препараты, местнораздражающее действие которых проявляется в концентрациях, существенно превосходящих их «терапевтические», т. е. рекомендованные к применению в клинике. В связи с этим при проведении доклинического изучения новых местных анестетиков совершенно необходимым является специальное исследование их местнораздражающих свойств.

Проявления местнораздражающего действия новых препаратов могут быть предварительно обнаружены при скрининге, например, при оценке терминальной анестезии методом Regnier на роговице глаза кролика или инфильтрационной анестезии на морских свинках (метод Bulbring и Wajda). При этом наблюдение за местом инъекции препарата проводят в течение недели, так как повреждающее действие наиболее отчетливо проявляется в этот период. Для более детальной оценки местнораздражающего эффекта исследуемых препаратов целесообразно использовать специальные методы.

6.1. Изучение местнораздражающего действия местноанестезирующих средств на крысах с помощью раствора трипанового синего

Исследования выполняют на белых крысах-самцах массой 120 г и более, которым в область хвоста после предварительного удаления волосяного покрова внутрикожно в 4 точки вводят по 0,1 мл раствора исследуемого соединения в концентрациях, убывающих в геометрической прогрессии. Для определения раздражающих свойств МС его раствор в каждой из исследуемых концентраций должен оцениваться не менее чем на 6 животных. Сразу после последней внутрикожной инъекции каждой крысе в бедренную вену вводят по 0,1 мл на 100 г массы тела 1% раствора трипанового синего. Степень раздражения тканей оценивают спустя 3 ч и 24 ч по 4-балльной шкале (табл. 16).

356

Для каждой концентрации высчитывают среднее арифметическое значение местнораздражающего действия в баллах и вычерчивают график зависимости раздражающего эффекта от концентрации (по оси абсцисс — логарифмы концентраций, по оси ординат — степень раздражающего действия). График позволяет определить 3 показателя местнораздражающего действия: 1) степень раздражающего действия, вызываемого 1% раствором соединения; 2) пороговую раздражающую концентрацию; 3) среднюю раздражающую концентрацию, при которой степень раздражения равна 2 баллам, т. е. концентрацию, не вызывающую необратимых изменений в тканях. Эти показатели также могут быть получены расчетным путем при использовании метода наименьших квадратов. Бесперспективными для клинического применения следует считать те соединения, у которых средние раздражающие концентрации приближаются к рекомендуемым к применению в клинической практике концентрациям.

6.2. Изучение местнораздражающего действия соединений на коже кролика

Исследования проводят на кроликах-самцах массой 2,5–3,0 кг. Заднюю поверхность спины вдоль позвоночника тщательно, без повреждения кожного покрова, освобождают от шерсти. Растворы анестетиков, приготовленные на изотоническом растворе натрия хлорида, вводят внутрикожно в объеме 0,1 мл. Места введения обводят чернилами. Необходимо использовать специальные шприцы и иглы. Местнораздражающий эффект оценивают через 24 ч по шкале:

357

Для каждой концентрации необходимо провести минимум 6 наблюдений в различных точках. Максимальный местнораздражающий эффект соответствует 10 баллам шкалы. Для каждой концентрации рассчитывают средние показатели в баллах, определяют среднюю раздражающую концентрацию, соответствующую 5 баллам. Определение средней раздражающей концентрации можно проводить так же, как описано в предыдущем методе.

6.3. Изучение местнораздражающего действия препаратов на слизистой оболочке глаза кролика

Исследуемые вещества в виде 2% растворов на изотоническом растворе натрия хлорида вводят в конъюнктивальный мешок в том же объеме, как и при определении анестезирующего действия веществ по методу Regnier. Одновременно проводят исследование местнораздражающих свойств новых соединений по указанной методике. Степень местнораздражающего действия соединений (средние данные 8 исследований) оценивают по четырехбалльной шкале через 3 ч и 24 ч после их введения в конъюнктивальный мешок глаза кролика (табл. 17).

При оценке действия препаратов можно использовать и промежуточные градации, например 2,5 и т.д. При резко выраженных проявлениях раздражающего действия препаратов оценка их местноанестезирующего эффекта невозможна из-за сильного блефароспазма.

Таблица 17

Оценка местнораздражающего действия местных анестетиков на слизистой оболочке глаза кролика

358

7. Программа скрининга местноанестезирующих средств

Скрининг местных анестетиков может проводиться с помощью любых из перечисленных выше методов в зависимости от задач и практических возможностей эксперимента. Однако при оптимизации скрининга — сокращении времени исследования, уменьшении его трудоемкости, повышении прогностического значения полученных результатов — при составлении программы исследования необходимо учитывать три обязательных условия. Во-первых, МА новых соединений должна быть изучена на моделях терминальной, инфильтрационной и проводниковой анестезии. Во-вторых, с учетов современных требований, предъявляемых к МС, исследование свойств новых веществ должны проводиться в сравнении с эталонными препаратами с использованием методов, позволяющих максимально точно (насколько это возможно в экспериментальных условиях) установить продолжительность их эффекта. В-третьих, наряду с исследованием МА новых соединений необходимо определить выраженность их местнораздражающего и общетоксического действия. Только при соблюдении этих условий может быть сделано наиболее полное и объективное заключение о МА исследуемого препарата при различных видах анестезии и о перспективах его клинического применения.

7.1. Первичный скрининг

Модели поверхностной (терминальной) анестезии

Изучение поверхностной анестезии на роговице глаза кролика по методу Regnier

(5.1.1).

Модели инфильтрационной анестезии

Изучение МА при инфильтрационной анестезии кожи у морских свинок по методу Bulbring и Wajda (5.2.1).

Изучение МА при инфильтрационной анестезии у крыс методом лучевой анальгиземетрии (5.3.9).

Изучение МА при инфильтрационной анестезии у мышей методом лучевой анальгиземетрии (5.4.1).

Модели проводниковой анестезии

Изучение МА при проводниковой анестезии седалищного нерва лягушки (5.3.1). Изучение МА при проводниковой анестезии у мышей по методу Bianchi (5.3.3). Изучение МА при проводниковой анестезии у крыс по методу Camougic и Takman

(5.3.4).

Изучение МА при проводниковой анестезии у крыс методом лучевой анальгиземетрии (5.3.9).

Изучение МА при проводниковой анестезии у мышей методом лучевой анальгиземетрии (5.4.1).

Методы выявления местнораздражающего действия

Изучение местнораздражающего действия у крыс с помощью раствора трипанового синего (6.1).

Изучение местнораздражающего действия на коже кролика (6.2).

Изучение местнораздражающего действия на слизистой оболочке глаза кролика (6.3). В перечень приведенных тестов первичного скрининга включены не один, а несколько методов оценки МА при однотипных видах местной анестезии, что дает более широкие возможности для выбора из них наиболее доступных для исследователя. При выборе программы скрининга следует иметь в виду, что наиболее информативными являются исследования МА новых соединений при разных видах анестезии у одного и того же вида животного в условиях однотипного ноцицептивного воздействия, поскольку это дает возможность объективной оценки основных параметров действия препаратов в сравнительном аспекте. Исходя из экономических соображений (расход изучаемого вещества, временные затраты) и вида животных, в программу скрининга рекомендуется включать методы комбинированного (одновременного) выявления МА веществ у мышей или

359

проведение последовательного определения МА новых соединений при терминальной, инфильтрационной и проводниковой анестезии на модели термического раздражения хвоста и комбинированного метода изучения местноанестезирующего и местнораздражающего эффектов препаратов на роговице глаза кроликов. Если использование комбинированных методов оценки по каким-либо причинам оказывается невозможным, допустимо применение любого из перечисленных выше методов, моделирующих различные виды анестезии.

При изучении МА новых соединений необходимо параллельно проводить оценку их местнораздражающего эффекта в месте введения в течение ближайших 1–5 сут. Для перспективных в плане клинического применения соединений целесообразно проведение последующего более детального исследования их местнораздражающего действия с использованием методов, сообразных с планируемым целевым назначением препарата (см. раздел 7).

Изучение острой токсичности

Врамках первичного скрининга предпочтительно изучать острую токсичность на мышах при внутрибрюшинном, внутривенном и подкожном введениях исследуемого соединения, с вычислением ЛД50 и дозы (из расчета использованного объема вещества

всоответствующей концентрации), вызывающей местноанестезирующий эффект в течение 1 ч у одних и тех же животных, может рассматриваться в качестве ориентировочного показателя терапевтической безопасности исследуемого соединения. Другим показателем терапевтической безопасности является соотношение средней тканераздражающей концентрации (СРК, см. 6.1, 6.2) с концентрацией, вызывающей местноанестезирующий эффект длительностью 1 ч.

Определение общетоксического действия соединений следует проводить в соответствии с общими требованиями настоящего Руководства.

Вдальнейшем с целью более детального исследования МА новых соединений с учетом предлагаемого способа применения в клинике должны использоваться методы углубленного (целевого) изучения.

7.2. Углубленное (целевое) изучение

Модели поверхностной (терминальной) анестезии

Изучение поверхностной анестезии на роговице глаза кролика по методу Regnier в более широком диапазоне концентраций (5.1.1).

Изучение МА при поверхностной анестезии слизистой оболочки глотки и трахеи кошек (5.1.2).

Изучение МА при терминальной анестезии хвоста у крыс (5.3.9).

Модели инфильтрационной анестезии

Изучение МА при инфильтрационной анестезии у морских свинок по методу Bulbring и Wajda (5.2.1) в более широком диапазоне концентраций.

Изучение МА при инфильтрационной анестезии брюшной стенки у кроликов (5.2.2).

Модели проводниковой анестезии

Изучение МА при проводниковой анестезии седалищного нерва у крыс (5.3.4). Изучение МА при проводниковой анестезии седалищного нерва у кроликов (5.3.6). Изучение МА при проводниковой анестезии нижнего дентального нерва у кроликов

(5.3.7).

Изучение МА при проводниковой анестезии большеберцового нерва у кроликов (5.3.8). Изучение МА при проводниковой анестезии блуждающего нерва у кошки (5.3.10). Изучение МА при проводниковой анестезии седалищного нерва лягушки (5.3.11).

Модели эпидуральной анестезии

Изучение МА при эпидуральной анестезии у кроликов через дужку позвонка (5.5.1). Изучение МА при эпидуральной анестезии у кроликов через межостистую связку

(5.5.2).

360