3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

скрининг потенциальных «противоалкогольных» средств при минимальных временных и экономических затратах.

На современном уровне знаний в качестве мишеней для фармакологического воздействия могут рассматриваться следующие проявления эффектов алкоголя: 1) острая интоксикация; 2) формирование алкогольной мотивации; 3) формирование зависимости; 4) состояние абстиненции; 5) восстановление алкогольной мотивации (рецидив после ремиссии). С учетом этого алгоритма и построены данные Методические рекомендации.

Основа методологических подходов к поиску средств лечения алкоголизма состоит в использовании батареи тестов, позволяющих оценить физиологические и биохимические изменения при остром и хроническом введении этанола, и на этом фоне анализировать эффекты веществ, отобранных для скрининга в качестве «противоалкогольных» средств.

1.2. Общие принципы проведения экспериментальных исследований

Эксперименты по изучению влияния фармакологических веществ на состояния, вызванные этанолом должны соответствовать следующим требованиям:

—использование только стандартного брикетированного сухого корма для лабораторных животных, так как различия в пищевом рационе, содержании жидкости в пище и

еекалорийности существенно сказываются на питьевом режиме животных [2];

—поддержание постоянной температуры окружающей среды, так как резкие колебания температуры значительно влияют на потребление алкоголя животными;

—контроль условий освещенности; при 12-часовом световом режиме (день/ночь) основное потребление этанола приходится на темное время суток [3];

—предоставление животным раствора этанола 10% или 15% концентрации в условиях их содержания в индивидуальных ячейках (клетках) или в группе при создании модели хронического алкоголизма в условиях свободного выбора между алкоголем и водой позволяет добиться добровольного потребления максимально больших доз алкоголя, оказывающих токсическое действие на организм [4,12,13]; в ряде случаев возможно использование растворов этанола в концентрациях от 5 до 20% [18];

—отсутствие вкусовых добавок к растворам для питья; использование вкусовых добавок к раствору этанола значительно отражается на его потреблении животными и на процессах формирования алкогольной мотивации, что при необходимости может быть использовано для ускорения процессов формирования алкогольной зависимости [4];

—применение пассивного содержания животных в парах этанола для оценки влияния веществ на сформированную физическую зависимость от алкоголя, на состояние абстиненции, а также для выявления способности ослаблять устойчивую алкогольную мотивацию в период лишения этанола;

—определение количества естественной потери жидкости из поилок в отсутствии животных для вычисления поправочного коэффициента;

—оценка отношения животных к алкоголю осуществляется путем ежедневного учета его потребления на единицу их массы;

—условия содержания животных; так как изоляционный стресс влияет на потребление этанола [5; 6], животных желательно содержать в группах, однако, при этом количественная регистрация индивидуального потребления алкоголя каждым животным осложняется. В случае оценки уровня алкогольной мотивации, индивидуальное содержание животных не является препятствием, так как фактор изоляционного стресса в определенной мере моделирует обстоятельства, способствующие развитию алкоголизма у людей.

1.2.1. Количество животных

Количество животных в каждой группе должно быть достаточным для оценки характера специфической фармакологической активности и выполнения статистической обработки полученных результатов.

311

1.2.2. Отбор животных

Проведение скрининга требует большого количества животных, поэтому в этих целях используют мелких лабораторных животных — в основном мышей и крыс. В связи с тем, что в условиях свободного выбора между алкоголем и водой только около 25% особей из популяции беспородных животных (крысы) отдают предпочтение алкоголю [7], для оптимизации поиска новых «противоалкогольных» средств, влияющих на формирование алкогольной мотивации, применяют дифференцированный подход к отбору животных. Оценка изначальных характеристик в популяции беспородных животных для выявления наличия или отсутствия склонности к потреблению этанола может проводиться:

1) в присутствии алкоголя:

—по результатам первоначального 10-дневного потребления этанола и воды в условиях свободного выбора;

—по продолжительности этанолового наркоза; длительность бокового положения у животных, предпочитающих алкоголь, в два раза ниже по сравнению с животными, предпочитающими воду [8];

2) в отсутствии алкоголя:

—разделение беспородных крыс на высокоактивных и низкоактивных особей на основании поведенческих показателей в тесте «неизбегаемое плавание», так как показано, что низкоактивные крысы отличаются склонностью к развитию депрессивноподобных состояний и формированию стойкой алкогольной мотивации по сравнению с высокоактивными животными [7].

Использование селективно выведенных линий и/или популяций грызунов, например, отобранных по признакам добровольного потребления раствора этанола и воды (Р/NP, AA/ANA, HAD1/HAD2, sP/sNP крысы) или различающихся по чувствительности к действию этанола (мыши LS / SS; Fast / Slow; Hot / Cold) целесообразно при изучении определенных аспектов патогенеза алкоголизма.

Для оценки генетической предрасположенности к различным проявлениям действия алкоголя могут применяться инбредные животные, отличающиеся по уровню потребления этанола при свободном выборе и по вызываемым эффектам. В таких случаях каждый эксперимент должен тщательно планироваться с учетом известных для выбранной линии данных, включая реакции, возникающие при длительном применении этанола.

1.3. Стратегия скрининга лекарственных средств для лечения алкоголизма

Основой поиска ЛС лечения алкоголизма являются данные о вызываемых алкоголем изменениях в нейрохимических процессах, нарушениях клеточного гомеостаза, иными словами, нарушениях в функциональных системах разного уровня. В качестве мишеней воздействия могут рассматриваться рецепторные образования, системы вторичных посредников, генетические, эпигенетические и другие механизмы. Главным при выборе мишени должно являться доказательство связи возникающих изменений с действием алкоголя.

1.3.1.Выбор препаратов сравнения

Вкачестве препаратов сравнения должны выбираться средства, наиболее эффективные для лечения конкретных проявлений воздействия этанола.

1.3.2.Статистическая обработка результатов исследования

Обработку полученных данных производят с помощью стандартных пакетов статистических программ с использованием параметрических и непараметрических критериев. Статистически значимыми признают различия при уровне вероятности р<0,05. Результаты представляют в виде таблиц или рисунков.

312

2.Поведенческие методы

2.1.Влияние фармакологических веществ на проявления алкогольной интоксикации при свободном поведении животных

Одним из поведенческих признаков интоксикации этанолом является нарушение координации движения или атаксия. Тесты для оценки локомоторной активности широко используются при анализе чувствительности к токсическому действию алкоголя [9]. Учитывая сложную природу данного феномена, целесообразно использовать комплексный подход для анализа влияния фармакологических веществ на различные проявления атаксии, в частности, потерю равновесия, «неровную походку» или потерю мышечной силы.

2.1.1. Визуальная оценка атаксии

Исследования проводят на мышах. Животное помещают на гладкую ровную неблестящую поверхность из ПВХ (50 см2), окруженную бортами высотой 5 см. До и после инъекций время наблюдения за одним животным составляет 45 с. Фиксируют наличие или отсутствие проявлений атаксии (см. Табл.1). После регистрации фонового уровня животным вводят внутрибрюшинно (в/б) этанол (20% раствор в дозах 2,75–3,25 г/кг) и помещают в индивидуальные ячейки. Через 10–15 мин после инъекции этанола животных повторно тестируют на наличие двигательных расстройств (см. табл.1). Изучаемое вещество вводят до инъекции этанола. Количество животных в контрольной и получающих ЛС группах составляет не менее 10 особей.

Интерпретация результатов.

Таблица 1

Способность изучаемых веществ восстанавливать нормальную походку рассматривается как проявление ими позитивного влияния

на нарушаемую этанолом координацию движений

Неспособность удерживать задние лапы под туловищем

0«Раскидывание» лап не наблюдается

1Кратковременное эпизодическое « раскидывание» лап во время движения

2Повторяющиеся «раскидывания» лап, способность двигаться по прямой линии

3Постоянное «раскидывание» лап, ограниченная координация (часто движение по кругу)

4Постоянное «раскидывание» лап, безуспешные попытки к движению

5Постоянное «раcкидывание» лап, отсутствие попыток к движению

Неустойчивая походка

0Отсутствие покачивания

1 Покачивание при движении и на месте

2Покачивания и падения

3 Падение из стороны в сторону, отсутствие движения

4Падение, неспособность подняться Неспособность поднять голову от пола во время движения Да/нет

Неспособность подняться на лапы при перемещении

Да/нет

По Metten P. еt al., 2004 [9], адаптировано.

313

2.1.2. Тест «вращающийся стержень»

Исследования проводят на мышах. Установка представляет собой приподнятый на высоту 60 см стержень диаметром 6 см с фиксированной скоростью вращения (3,0, 6,5 и/или 10,0 об/мин). При изучении влияния фармакологических веществ на алкогольную интоксикацию мышей предварительно тестируют не менее трех раз (время каждой экспозиции составляет 3 мин) для достижения стабильных показателей. Этанол вводят (20% раствор в дозах 1,25–1,75 г/кг, в/б) за 30 мин до тестирования. Доза этанола выбирается с учетом экспериментальных данных, согласно которым низкие дозы этанола улучшают поведенческие характеристики мышей в данном тесте, а доза 2,0 г/кг и более является слишком высокой для тестирования через заданный интервал времени. Основной регистрируемый показатель — время удержания на стержне [10].

Интерпретация результатов. Способность животных сохранять равновесие и увеличивать время нахождения на вращающемся стержне под действием изучаемого вещества, вводимого на фоне этанола, рассматривают как способность уменьшать токсическое действие этанола и восстанавливать координацию движения.

2.1.3. Тест «перекладина»

Исследования проводят на мышах. Установка представляет собой деревянную перекладину шириной 2 см, толщиной 4 см и длиной 122 см, приподнятую на высоту 48 см от уровня стола. До начала эксперимента животным предоставляют возможность дважды пройти по перекладине в обоих направлениях. По окончании процесса обучения вводят этанол (20% раствор, дозы 1,0–1,4 г/кг, в/б) и помещают мышей в индивидуальные ячейки. Через 10 мин повторно тестируют и регистрируют количество «соскальзываний» задних лап, «оступлений» при перемещении животного с одного конца перекладины до другого. Если животные останавливаются более чем на 1 сек, то, как и во время обучения, их следует слегка подтолкнуть за задние лапы для инициации движения. В случае падения животное сразу же поднимают за хвост и сажают на то место, откуда оно упало. При разворачивании животного назад, экспериментатор поднимает животное за хвост и ориентирует на заданное направление [11]. Изучаемое вещество (исследуемая группа) или растворитель (контроль) вводят животным до введения этанола, исходя из фармакокинетических особенностей вещества. Количество животных в каждой группе не менее 10.

Интерпретация полученных результатов. Уменьшение количества «соскальзываний» задних лап на перекладине в получающей ЛС группе по сравнению с контрольной рассматривают как способность изучаемого вещества уменьшать токсическое действие этанола и восстанавливать координацию движения.

Данный тест является более чувствительным к низким дозам этанола по сравнению с тестом «вращающийся стержень», так как этанол в дозах свыше 1,5 г/кг делает большинство мышей неспособными выполнить поставленную задачу.

Дополнительным критерием для объективной оценки состояния животных является определение содержания этанола в крови сразу после окончания тестирования на «перекладине» (см. пункт 8).

2.1.4. Тест «крестообразный лабиринт»

Исследования проводят на мышах и крысах. «Крестообразный лабиринт» (КЛ) [12] состоит из 4-х камер, пронумерованных 1, 2, 3, 4, которые соединяются между собой через такую же пятую центральную камеру. Тупиковые и центральная камеры КЛ для мышей представляют собой куб с ребром длиной 15 см и отверстием для входа сечением 7×7 см. В КЛ для крыс центральная камера представляет собой куб с ребром длиной 20 см, а тупики имеют размеры 30×20×20 см и соединяются с центральной камерой отверстием для входа сечением 12×12 см.

Животное помещают в центральную камеру, сверху КЛ закрывают прозрачной крышкой и позволяют ему исследовать новое пространство до тех пор, пока животное не

314

произведет 13 посещений его тупиковых камер. Заход в тупик считают состоявшимся, если животное переносит все 4 лапы в это отделение КЛ. Оценивают следующие виды поведения.

1.Общее время в КЛ, затраченное на 13 заходов в его тупики, свидетельствует об уровне исследовательской активности.

2.Латентный период начала исследования КЛ, то есть время между помещением животного в центральную камеру и его первым заходом в тупик. Этот показатель позволяет дифференцировать анксиолитические свойства изучаемых веществ и коррелирует

сизбеганием посещения открытых рукавов «приподнятого крестообразного лабиринта», стандартного теста для оценки тревожности.

3.Время полного обхода лабиринта, то есть посещение всех отсеков, отражает способность к пространственной ориентации и рассматривается как одна из форм элементарной рассудочной деятельности у животных. Уменьшение числа визитов, потребовавшихся для совершения первого полного обхода, и увеличение общего числа полных обходов указывают на совершенствование пространственной организации.

4.Количество возвратов в тупик, посещенный при предыдущем визите, рассматривается как показатель ошибок краткосрочной памяти.

5.Поочередное посещение двух из четырех тупиков, которое интерпретируется как поведенческая стереотипия.

6.Количество правых и левых поворотов при переходе из тупика в тупик через центральный отсек лабиринта отражает степень асимметрии локомоции.

По результатам тестирования сравнивают поведенческие проявления в КЛ у животных контрольной группы, у животных на фоне действия этанола per se с группой животных, которым до применения этанола вводили изучаемое вещество.

Интерпретация полученных результатов. Данный метод позволяет количественно оценить вызываемые алкоголем изменения поведенческих характеристик у животных, включая исследовательскую активность, эмоциональный статус, пространственную ориентацию, элементы «рассудочной» деятельности, краткосрочной памяти, стереотипного поведения, и может быть использован для выявления характера эффективности изучаемых веществ на фоне алкогольной интоксикации разного уровня, в условиях хронического потребления этанола, а также при алкогольной абстиненции (см. пункт 4.). Ослабление вызываемых алкоголем изменений поведения животных в КЛ под влиянием изучаемых веществ может указывать на их позитивный «противоалкогольный» эффект по отношению к поведенческим характеристикам, которые регистрируют в данном тесте.

2.1.5.Продолжительность этанолового наркоза

2.1.5.1. Тест-доза этанола для алкогольного наркоза Исследования проводят на мышах или крысах. Животным вводят 25% раствор эта-

нола в тест-дозе (4–5 г/кг, в/б), вызывающей развитие алкогольного наркоза, который сохраняется в течение 1–2 ч, что позволяет выявить как ослабление, так и усиление действия этанола. Животных размещают на ровной горизонтальной поверхности и регистрируют время наступления и окончания алкогольного наркоза по принятию «бокового положения» и, соответственно, самостоятельному устойчивому выходу из него. В зависимости от схемы эксперимента изучаемое вещество вводится до тест-дозы этанола или на фоне этанолового наркоза. Контрольной группе животных вводят раствор этанола в тест-дозе и изомерное количество растворителя, используемого для изучаемого вещества, в соответствии с выбранными временными интервалами для конкретного эксперимента. В состав каждой группы входят не менее 10–12 особей. Данный тест является чувствительным к температуре окружающей среды и физиологическому состоянию животных. Продолжительность алкогольного наркоза может варьировать

315

при сезонных колебаниях, а также при использовании различных популяций животных. Следует иметь в виду, что характер продолжительности алкогольного наркоза в известной степени обратно пропорционально коррелирует с характером объемов потребления алкоголя в условиях свободного доступа животных к раствору этанола и воде [4, 13].

Объем вводимого 25% раствора этанола (V) в соответствии с его необходимой дозой

(D) с учетом массы животного (М) рассчитывают по формуле:

2.1.5.2. «Субнаркотическая» доза этанола При введении этанола в «субнаркотической» дозе используется не менее 3-х групп

из 6-ти животных в соответствии со ступенчатым возрастанием дозы этанола в пределах от 3,0 до 4,7 г/кг, в/б, отдельно для каждой группы по отношению к первой группе животных. Животным контрольной группы вводят раствор этанола в тест-дозе и изомерное количество растворителя, используемого для изучаемого вещества, в соответствии с выбранными временными интервалами для конкретного эксперимента. Рассчитывают величину ЕД50 (также ЕД10 , ЕД100 и др.) этанола по количеству животных, принявших или не принявших «боковое положение» под влиянием 25% раствора этанола для контрольной и получающих ЛС групп животных [13].

Интерпретация полученных результатов. Основные проявления этанолового наркоза характеризуются резким угнетением функции ЦНС, когда в первую очередь возникает миорелаксация и значительно ослабляются двигательные и вегетативные реакции в ответ на внешние стимулы. Указанное состояние развивается при условии превышения в крови «пороговой» концентрации этанола. При последующем уменьшении концентрации этанола ниже «пороговой» («субнаркотической») концентрации этанола в процессе его метаболизма происходит восстановление угнетенной этанолом функции ЦНС и, соответственно, выход из состояния наркоза («бокового положения»).

Продолжительность алкогольного наркоза может считаться производным от времени нахождения в крови этанола в концентрации, превышающей «пороговую», и косвенно отражает функциональную активность этанол-окисляющих систем. Следует иметь в виду, что на длительность алкогольного наркоза также могут влиять вещества с общим депримирующим эффектом. C учетом возможных вариантов полученных результатов, могут быть сделаны следующие выводы (таблица 2):

316

Условные обозначения: за единицу принимаются эффекты этанола в соответствии с его тест-дозой для изучения продолжительности алкогольного наркоза или ЕД50 по «боковому положению».

2.1.6. Выживаемость животных при острой алкогольной интоксикации

Исследования проводят на мышах или крысах. Животным интрагастрально вводят этанол в виде 50% раствора в дозе, соответствующей ЛД50 (для мышей 10,0 г/кг) и дозе, приближающейся к ЛД100 (для мышей 12,0 г/кг). Изучаемое вещество вводят однократно или многократно после интоксикации этанолом. Через 24 и 48 ч регистрируется число погибших животных и вычисляется % выживаемости для контрольной и получающих ЛС групп соответственно. Дополнительно проводят визуальное наблюдение за состоянием животных через 24 и 48 ч после начала алкогольной интоксикации. Число животных в каждой группе составляет не менее 20 особей.

Интерпретация полученных результатов. Способность веществ увеличивать выживаемость животных в условиях использования этанола в дозах, близких к летальным, свидетельствует о наличии антиалкогольных эффектов, препятствующих проявлению токсического действия этанола.

Поиск новых фармакологических средств для выведения из алкогольной комы может оказаться перспективным среди веществ, ускоряющих элиминацию этанола и его метаболита ацетальдегида, среди возможных (специфических или неспецифических) антидотов, а также веществ, активирующих функцию ЦНС, ССС, дыхательной и других систем. Увеличение скорости элиминации этанола в этих условиях под действием фармакологических веществ может указывать на активацию ферментных систем, участвующих в метаболизме этанола, а ее уменьшение — свидетельствовать о подавлении этих функций.

2.1.7. Влияние фармакологических веществ на состояние животных после умеренной, средней

и тяжелой алкогольной интоксикации

Для экспериментов используют животных, перенесших алкогольную нагрузку трех уровней: I — относительно невысокая (животные, перенесшие действие этанола в «субнаркотической» дозе; см. пункт 1.5.2.), II — средней тяжести (животные, перенесшие алкогольный наркоз; пункт 1.5.1.), III — тяжелая (животные, выжившие после применения этанола в дозе ЛД50; пункт 1.6.).

Животных тестируют через 24 и 48 ч после введения этанола согласно экспериментам, обозначенным в перечисленных выше пунктах. При этом можно использовать животных, перенесших аналогичную острую алкогольную интоксикацию в предыдущих исследованиях (см. 1.5.1.; 1.5.2. и 1.6.), но только тех животных, которые соответствовали контрольным группам без применения фармакологических веществ. Изучаемые вещества вводят перед тестированием животных.

Оценку состояния животных после умеренной, средней и тяжелой алкогольной интоксикаций осуществляют аналогично тестам по изучению уровня алкогольного опьянения в условиях свободного поведения животных (пункты 1.1–1.4.; 4.1–4.3.), однако, в этом случае эксперименты должны исключать применение алкоголя. Могут быть также использованы стандартные методы инструментальной оценки артериального давления, ЭКГ, частоты дыхательных движений у животных и др.

317

Интерпретация полученных результатов. Ослабление под влиянием изучаемых веществ последствий, обусловленных умеренной, средней и тяжелой алкогольной интоксикацией, будет свидетельствовать о позитивном действии этих веществ в части нормализации негативных процессов, возникающих при действии этанола.

2.2.Формирование алкогольной мотивации

2.2.1.Потребление алкоголя в условиях ограниченного доступа

краствору этанола в «темное» время суток («Drinking in the dark»)

Методика представляет модель добровольного «избыточного» потребления этанола у мышей, приводящего к достижению физиологически значимых концентраций этанола в крови (50–200 мг% и выше). Эксперименты могут быть проведены в двух вариантах:

Вариант А. Исследования проводят на мышах линии C57Bl/6J с генетически обусловленной предрасположенностью к высокому потреблению алкоголя (до 80 мг % этанола в крови). В условиях содержания животных в индивидуальных клетках поилку с водой заменяют на поилку, содержащую раствор этанола, через 3 ч после начала «темной» фазы суточного цикла день/ночь (12 ч/12 ч) и предоставляют свободный доступ к 20% этанолу в течение 2-х ч. Указанную процедуру повторяют ежесуточно в течение 4-х дней до достижения стабильных результатов по потреблению этанола. На 5-й день по той же схеме изучаемое вещество для отдельных групп лабораторных животных, получающих ЛС, или растворитель (контроль), вводят за 30 мин до предоставления им раствора этанола. Регистрируют количество выпитого раствора этанола в г/кг массы тела в заданный временной интервал, взвешивая поилку с этанолом до и после помещения в клетку (или с помощью учета изменений объемов потребления жидкостей, если применяли градуированные мерные поилки). Сравнивают объемы потребления жидкостей у контрольной и получающей ЛС групп животных. В процессе эксперимента после регистрации уровней потребления этанола измеряют концентрацию этанола в крови животных (см. пункт 8.) [14, 15].

Вариант Б. Исследования полностью соответствуют описанной выше процедуре, за исключением того, что животным в «темный» период помимо раствора этанола предоставляется поилка с водой [16].

Отличие представленных вариантов: в первом случае (вариант А) имеет место насильственное предоставление только этанола А, во втором животным предоставляется добровольный выбор между потреблением раствора этанола и водой, то есть, более естественные («мягкие») условия.

Интерпретация полученных результатов. Уменьшение потребления алкоголя на фоне применения изучаемого вещества будет свидетельствовать о наличии у него способности ослаблять алкогольную мотивацию. Данная модель может быть использована для скрининга потенциальных фармакологических веществ, влияющих на избыточное потребление алкоголя, а также для выявления новых генетических и нейробиологических механизмов, способствующих развитию алкоголизма [17].

2.2.2.Добровольное потребление алкоголя

вусловиях круглосуточного свободного выбора между раствором этанола

иводой в первые недели контакта с этанолом

Исследования проводят на крысах или мышах. Для данного эксперимента и для последующих возможен дифференцированный отбор животных по результатам предварительного тестирования по реакции животных на острое введение этанола (тест 1.5.1) или при отсутствии этанола (по особенностям их поведенческих различий). Животных помещают в индивидуальные клетки с круглосуточным свободным доступом к двум мерным поилкам, содержащим 10% или 15% этанола и воду, а также к стандартному брикетированному сухому корму. До начала исследований по результатам предварительного

318

48-часового (фонового) содержания животных в этих условиях для участия в продолжении эксперимента отбирают особей, предпочитавших 10% или 15% раствор этанола (в объемах не менее 10–15 мл/кг/сут), которых группируют (не менее, чем по 10–15 особей) по равновеликим количествам потребляемого алкоголя за этот период. Затем у животных ежесуточно в течение 14 дней регистрируют потребление алкоголя в пересчете на чистый этанол в г/кг массы тела. Изучаемые вещества и растворитель (контроль) вводят в одно и то же время суток в соответствии с выбранным способом введения и частотой их применения в зависимости от известных или предполагаемых свойств взятых веществ. Подсчитывают среднесуточное потребление алкоголя отдельными животными за указанное время исследования. Сравнивают динамику изменений объемов добровольно потребленного алкоголя на фоне применения веществ (14 дней) и после их отмены (в последующие 7 дней).

Интерпретация полученных результатов. В случае уменьшения добровольного потребления этанола на фоне применения изучаемых веществ можно сделать заключение о способности этих веществ ослаблять формирование алкогольной мотивации. Уменьшение потребления алкоголя за 7-дневный период после отмены указанных веществ будет свидетельствовать об устойчивости проведенной «позитивной терапии» для последующего добровольного потребления этанола.

2.3.Формирование зависимости от алкоголя

2.3.1.Добровольное потребление алкоголя

вусловиях хронического круглосуточного свободного доступа к этанолу и воде

Вариант А. Эксперименты проводят на крысах, потребляющих относительно боль-

шие количества 10% или 15% этанола (50–60 мл/кг в сутки). Оценивают влияние изучаемого вещества на добровольное потребление алкоголя животными хронически (не менее 3–4 месяцев) потреблявшими его стабильные объемы (из расчета на 1 кг веса в сутки) в условиях свободного выбора между 10% или 15% этанолом и водой. Сравнивается потребление алкоголя до применения изучаемого вещества (1 неделя), на фоне применения вещества (2 недели) и после его отмены (1 неделя). Подсчитывают среднесуточное потребление алкоголя отдельными животными за каждую из указанных недель. Далее, вычисляют среднее потребление алкоголя по соответствующей группе животных за каждую неделю и сопоставляют данные о потреблении за 1 неделю (до инъекций) с данными по потреблению раствора этанола животными для каждой из последующих недель; потребление алкоголя за 1-ю неделю принимается за 100% и рассчитывается (в %) динамика потребления за все последующие недели.

Вариант Б. Метод 4-х бутылочной пробы, согласно которому животным в течение нескольких месяцев предоставляют для свободного выбора этанол в следующих концентрациях 0%, 5%, 10% и 20% [18]. Данный подход позволяет идентифицировать особей, у которых наблюдается постепенный переход от контролируемого к неконтролируемому (обязательному) потреблению этанола. У животных выделяют следующие поведенческие изменения, характерные для сформировавшейся алкогольной зависимости: 1) значительное увеличение потребления алкоголя преимущественно за счет растворов с высокой концентрацией (т.е., 20%) и 2) изменение временного паттерна алкогольного поведения (т.е., отсутствие отличий в потреблении алкоголя в темное и светлое время суток). Оценка влияния изучаемого вещества на хроническое добровольное потребление алкоголя животными (не менее 3–4 месяцев) осуществляется в полном соответствии с описанной в пункте «А» с учетом объемов потребления растворов этанола указанных концентраций.

Интерпретация полученных результатов. Уменьшение потребления алкоголя на фоне применения изучаемого вещества будет свидетельствовать о наличии у него способности ослаблять влечение к алкоголю в условиях сформированной алкогольной мо-

319

тивации. Уменьшение потребления алкоголя после отмены изучаемого вещества будет указывать на его стойкий терапевтический эффект.

Оценка и интерпретация эффекта изучаемых веществ по характеру вызываемых ими изменений в проявлениях состояния абстиненции после отмены добровольного хронического потребления этанола у животных осуществляются в полном соответствии с описанными в пунктах 1.2. и 1.3. за исключением позиций, рассмотренных для принудительной алкоголизации в парах этанола.

2.3.2. Ускоренное формирование алкогольной зависимости

Для осуществления процедуры ускоренного формирования алкогольной зависимости целесообразно использовать отобранных животных, предпочитающих раствор этанола по результатам предварительной 2-недельной регистрации объемов потребления алкоголя в условиях свободного доступа к этанолу и воде (см. пункт 3.1.) или животных с короткой продолжительностью алкогольного наркоза (пункт 1.5.1.).

2.3.2.1. Содержание животных в условиях, при которых раствор этанола используют в качестве единственного источника питья

Предоставление крысам, потребляющим стабильно большие количества алкоголя (50–60 мл/кг в сутки), раствора 10% или 15% этанола в качестве единственного источника жидкости при свободном доступе к корму [19] в течение 8 недель. У мышей в аналогичных условиях используют раствор этанола 20% концентрации [20].

При использовании раствора этанола в качестве единственного источника питья

уживотных оценка характера абстинентных проявлений как критерия уровня развития физической зависимости (см. пункт 4) осуществляется по динамике их нарастания после дробной отмены в процессе процедуры хронического потребления этанола. Показатели этих проявлений у животных контрольной группы (без применения изучаемых веществ) могут быть сопоставлены с результатами, полученными

уживотных, которым по выбранной схеме вводили изучаемые вещества ежедневно в процессе алкоголизации.

Интерпретация полученных результатов: ослабление скорости нарастания проявлений алкогольной абстиненции в данном тесте свидетельствует о том, что изучаемое вещество препятствует формированию физической зависимости от этанола.

2.3.2.2.Ускоренное формирование алкогольной зависимости

в условиях пассивного содержания животных в парах этанола

Относительно быстро проявления физической зависимости (тремор, ригидность хвоста, характер вздрагивания на шум, судороги) от алкоголя при его отмене у животных, по сравнению с последствиями их содержания при свободном доступе к воде и этанолу в обычных условиях, достигаются посредством хронического содержания животных в атмосфере паров этанола. Для крыс указанное состояние достигается после их нахождения в атмосфере, содержащей пары этанола в концентрации 15–22 мг/л в течение 30 суток.

Эти проявления могут быть достигнуты в существенно короткие сроки при более жестких условиях круглосуточного вдыхания животными атмосферы с максимально высокими концентрациями этанола, но не приводящими за выбранный период хронической экспозиции к гибели животных (концентрации этанола подбираются экспериментально, с учетом постоянной температуры окружающей среды 18–22 °С и достаточной концентрации кислорода для нормального дыхания животных при постоянном протоке воздуха через экспериментальные камеры).

Указанный вариант исследования, также как и в условиях использования раствора этанола в качестве единственного источника питья, позволит значительно уменьшить экономические и временные затраты на проведение скрининга. Эксперименты осу-

320