5 курс / Пульмонология и фтизиатрия / Бронхиальная_астма_В_2_томах_Том_1_Чучалин_А_Г_1997

ЛИТЕРАТУРА

Черняев АЛ, Жаворонков АА. Патоморфологическая и морфометрическая диагностика бронхоспастического синдрома при хроническом диффузном бронхите и бронхиальной астме. Арх патол 1981; 3:60-6.

Beasley R, Roshe WR, Roberts JA et al. Cellular events in the bronchi in mild asthma and after bronchial provocation. Am Rev Respir Dis 1989; 139:806-17.

Busse WW, Calhoun WF, Sedgwick JD. Mechanism of airway inflammation in asthma. Am Rev Respir Dis 1993; 147:S20-S24.

Chuchalin AG, Grobova OM, Chemiaev AL et al. The delayed Respiratory Consequences of inhaled Radionuclides in population exposed to nuclear catastrophe. Stem cells 1995; 13(Suppl 1:276-83).

Djukanovic R, Wilson RW, Lai CKW et al. The safety aspects of fiberoptic bronchoscopy, bronchoalveolar lavage, and endobronchial biopsy in asthma. Am Rev Respir Dis 1991; 143:772-7.

DunnilMS. Palmonary pathology. Churchill Livingstone: Edinburgh, 1982:50-60.

European Society of Pneumology Task Group on BAL. Technical recomendation and guidelines for bronchoalveolar lavage (BAL). Eur Resp J 1989; 2:561-85.

Fabbri LM, Maestrelli P, Saetta M et al. Airway inflammation during late asthmatic reactions induced by toluene diisocyanate. Am Rev Respir Dis 1991; 143(Suppl:37-8).

Hunt LW, Mansfield ES, Sur Set al. Late neutrophilic response to bronchial allergen challenge: A response to endotoxin? J Allergy Clin Immunol 1992; 89: 335.

Laitinen A. Epithelial damage in glucocorticoids and mechanism of asthma. Excerpta Medica: Amsterdam 1989: 215-229.

Laitinen A. Ultrastructural organization ofintraepithelial nerves in the human airway tract. Thorax 1985; 40:488-92.

Laitinen LA, Heino M, Laitinen A et al. Damage ofthe airway epithelium and bronchial reactivity in patients with asthma. Am Rev Respir Dis 1985; 131:599-606.

Laitinen LA, Laitinen A. Mucosal inflammation and bronchial hyperreactivity. Eur Respir J 1988; 1:488-89.

Laitinen LA, Robinson NP, Laitinen A, Widdicombe JG. Relationship between mucosal thickness and vascular resistance in dogs. J Appl Physiol 1986; 61:2186-93.

Laitinen LA, Robinson NP, Widdicombe JG. Effects of inflammatory and other mediators on airway vascular beds. Am Rev Respir Dis 1987; 67-70.

Lee TN. Mechanism of aspirin sensitivity. Am Rev Respir Dis 1992; 145 (Suppl:34-6).

Lundgren R, Soderberg M, Horstedt P, Stenling R. Morphological studies of bronchial mucosal biopsies from asthmatics before and after ten years of treatment with inhaled steroids. Eur Respir J 1988; 1:883-89.

Mengelers HJ, Maikoe T, Brinkman L et al. Immunophenotyping of eosinophils recoved from blood and BAL of Allergic Asthmatics. Am Rev Respir Dis 1994; 149:345-51.

National Institutes of Health. Workshop summary and guidelines: Investigative use of bronchoscopy, lavage, and bronchial biopsies in asthma and other airway diseases. J Allergy Clin Immunol 1991; 88:808-14.

Robinson DS, Hamid Q, Ying S et al. Predominant Th2-like bronchoalveolar T-lymphocytes population in atopic asthma. N Engl Med 1992; 326:298-304.

Robuschi M, Riva E, Fuccella LM et al. Prevention of exercise-induced bronchoconstriction by a new leukotriene antagonist (SK&F 104353). Am Rev Respir Dis 1992; 145:1285-8.

Smith DL & Deshazo RD. Bronchoalveolar lavage in asthma: an update and perspective. Am Rev Respie Dis 1993, 148:523-32.

50

Soderberg M, Hellstrom S, Sandstrom S et al. Structural characterization of bronchial mucosal biopsies from healthy volunteers: a light and electron microscopical study. Eur Respir J 1990; 3:261-

66.

The BAL Cooperative Group Steering Commity. Bronchoalveolar lavage constituents in healthy individuals, idiopatic pulmonary fibrosis, and selected comparison groups. Am Rev Respir Dis 1990: 141(5 Part 2:S169-202).

van Vyve T, ChanezP, Bousquet J et al. Safety of bronchoalveolar lavage and bronchial biopsies in patients with asthma of variable severity. Am Rev Respir Dis 1992; 146:116-21.

WardlawA3, Dunnette S, Gleich GJet al. Eosinophils and mast cells in bronchoalveolar lavage in subjects with mild asthma. Am Rev Respir Dis 1988:137:62-9.

51

С.Н. Орлов, И.А. Баранова Н.И. Покудин

Гладкомышечныеклетки: внутриклеточныесистемы сигнализациии патология легких

Впоследние десять-пятнадцать лет достигнут существенный прогресс

ввыяснении молекулярных механизмов функционирования сигнальных систем клетки, т.е. систем, ответственных за восприятие и проведение гор­ мональных и электрических сигналов от рецепторов на белки-исполните­ ли. Эти системы выполняют ключевую роль в координации работы мно­ гоклеточных ансамблей, в том числе такого сложно устроенного органа, каким являются легкие. Неудивительно, что даже небольшие (генетичес­ ки детерминированные или приобретенные благодаря воздействию внеш­ них неблагоприятных факторов) изменения компонентов сигнальных си­ стем приводят к развитию патологических состояний. Эти же системы рас­ сматриваются как основные и наиболее эффективные мишени при разра­ ботке новых фармакологических препаратов. В этой главе мы постараем­ ся суммировать данные о молекулярно-биологической природе патогене­ за и терапии некоторых заболеваний легких, затрагивающих сигнальные системы гладкомышечных клеток воздухопроводящих путей (ГМК ВП).

Вобзоре мы не рассматриваем сигнальные системы, активируемые ре­ цепторами, ковалентно связанными с киназами тирозинового типа и гуанилатциклазой. В большинстве случаев первые события разворачиваются на уровне плазматической мембраны, где локализованы рецепторы ней­ ромедиаторов и пептидных гормонов (R,). Активированные рецепторы взаимодействуют с ГТФ-связывающими белками (Gp), которые передают информацию на мембранные белки-мишени (Т,). В ограниченном числе

52

случаев (постсинаптические Na-каналы, потенциалоперируемые ионные каналы) рецептор (в данном случае n-холинорецептор и сенсор мембран­ ного потенциала, соответственно) локализован на молекуле Тр и сигнал передается без участия Gp. Активированный Т, контролирует внутрикле­ точную концентрацию вторичных посредников (М), которые в свою оче­ редь модифицируют активность цитоплазматических белков-мишеней (Т2). Последние контролируют функциональную активность, воздействуя на белки-исполнители. Ряд соединений (стероидные и тиреоидные гор­ моны) свободно проникают через цитоплазматическую мембрану, взаи­ модействуют с цитоплазматическими рецепторами (R2), которые попадая в ядро, изменяют экспрессию белков, в том числе и тех, которые образуют сигнальную систему. Рецепторы R, типа, взаимодействующие с ГТФ-свя- зывающими белками, относятся к суперсемейству белков, уникальным свойством которых является наличие семи а-спиралей, пронизывающих мембрану, и набора участков для потенциального фосфорилирования, ло­ кализованных на С-конце, обращенном в цитоплазму. Установлено, что один такой рецептор может активировать 10—1000 молекул Gp. Такой же коэффициент усиления сигнала существует и на остальных этапах прове­ дения сигнала (Gp -» Тр Т, —»М, М —>Т2), обеспечивая таким образом колоссальный коэффициент усиления 106-1 0 12, что не уступает, а зачас­ тую и превосходит коэффициенты усиления современных систем приема радио- и телесигналов. Продолжая эту аналогию, необходимо отметить, что другим достоинством клеточной сигнализации является ее избиратель­ ность, то есть крайне низкое отношение сигнал/шум, на фоне которого ей приходится работать. Высокая селективность клеточного ответа при акти­ вации сигнальных систем определяется следующими факторами:

1.Вариабельностью и стереоспецифичностью рецепторов для целого ряда химических, электрохимических, световых и тепловых стимулов. Так, только для нейромедиаторов их число достигает тридцати. Более того, одни

ите же нейромедиаторы могут взаимодействовать с разными рецептора­ ми, и набор этих рецепторов тканеспецифичен. Так, например, к настоя­ щему времени известно около 10 типов рецепторов катехоламинов и 5 ти­ пов рецепторов ацетилхолина.

2.Большим набором Gp, состоящих из трех субъединиц (а, Р, у). К на­ стоящему времени известно около 20 а-субъединиц и 4 типа р и у-субъе- диниц, что увеличивает общее число комбинаций приблизительно до 300.

3.Разнообразием мишеней Тр локализованных на плазматической мем­ бране. Например, ионные каналы различаются по селективности, прово­ димости, чувствительности к изменениям мембранного потенциала и вза­ имодействию с Gp. Ферменты, регулируемые Gp, имеют большое число изо­

53

форм, отличающихся по механизму регуляции их активности (аденилатциклаза - 6, фосфолипаза С - 5 изоформ, фосфолипаза А2 - 6).

4. Наличием нескольких вторичных посредников, среди которых наи­ более полно изучены циклические нуклеотиды (cAMP, cGMP), продукты гидролиза фосфолипидов (инозитолфосфаты и диацилглицерол) и каль­ ций. Кроме того, в последнее время функции вторичных посредников при­ писываются полифосфоинозитидам (PIP и Р1Р2), лизофосфатидной кис­ лоте, продукту гидролиза сфингомиелина, керамиду и др. В ряде случаев вторичные посредники диффундируют из клетки и воздействуют на спе­ цифические рецепторы, локализованные на этой же или соседних клет­ ках (так называемые короткодистантные гормоны, например, простагландины и лейкотриены, образующиеся при активации фосфолипазы А^). Этот механизм, а также другие пути передачи сигнала образуют сложную тка­ неспецифичную систему обратных связей, обеспечивающую согласован­ ную работу (cross-talking) сигнальных систем.

В следующих разделах будут рассмотрены специфические особенности сигнальных систем на примере клеток гладкой мускулатуры воздухопро­ водящих путей.

Основным триггером сокращения гладкомышечных клеток (Harsthome, 1992) является прирост концентрации ионизированного кальция Са2+Г Этот прирост обеспечивается как за счет спонтанной электрической активнос­ ти клеток, открытия потенциалуправляемых каналов и входа Са2+ из вне­ клеточного пространства, так и за счет высвобождения кальция из саркоплазматического ретикулума (SR). В ГМК ВП последний путь повыше­ ния внутриклеточной концентрации кальция доминирует (Bourreau, 1993). В данном случае сигналом к этому является высвобождение инозитолтрифосфата (1Р3) при гидролизе трифосфоинозитидов (Р1Р2) специфической фосфолипазой С (PLC). В свою очередь PLC связана с целым спектром рецепторов R, типа (в данном случае приведен М-холинорецептор). Вболь­ шинстве случаев эта связь опосредована через Gi или неидентифицированные ГТФ-связывающие белки (Gp). Согласно последним данным, 1Р3 фосфорилируется СаМ-зависимой протеинкиназой до инозитол 1,3,4,5- тетрафосфата (1Р4), и это соединение может приводить к открытию рецепторуправляемых Са2+-каналов плазматической мембраны. При увеличе­ нии Са2+ в диапазоне от 10'7 до 10'6 происходит его связывание с универ­ сальным цитоплазматическим регулятором —кальмодулином (СаМ) и ак­ тивация киназы легких цепей миозина (MLCK). Именно этот фермент, осуществляя фосфорилирование миозина (М), инициирует его взаимодей­ ствие с актином (А) и сокращение ГМК. Другой продукт гидролиза Р1Р2 фосфолипазой С диацилглицерол является мощным активатором проте-

54

инкиназы С. Механизм вовлечения этого фермента в регуляцию сокраще­ ния ГМК до сих пор не установлен.

Нарушение контроля цитозольной концентрации кальция, приводящее к повышенной контрактильности гладкомышечных клеток, выявлено при ряде заболеваний, в том числе и при бронхиальной астме. Патология об­ мена Са2+ вследствие изменения рецепторного аппарата, регуляторных белков приводит к гиперреактивности и клеточному росту (Sakai, 1993).

С теоретической точки зрения могут быть выделены следующие пути контроля гомеостаза кальция в ГМК ВП при бронхиальной астме:

—для предотвращения сокращения с целью профилактики приступа воз­ можно использование антагонистов рецепторов, ингибиторов входа вне­ клеточного кальция и его высвобождения из саркоплазматического ретикулума, антагонистов кальмодулина и контрактильных белков;

- для снятия усиленного контрактильного ответа при симптоматичес­ ком лечении астмы могут быть ингибированы вход кальция, инозитолтрифосфатный метаболизм, протеинкиназа С, усилен механизм выхода кальция за счет функционирования Са2+-АТФазы и Ыа+/Са2+-обменника сарколеммы и Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума.

Приведенная здесь схема объясняет механизм действия основных клас­ сов лекарственных препаратов, используемых в качестве бронхолитиков или рассматриваемых как потенциально перспективные в этом плане со­ единения. Это особенно важно в терапии бронхообструктивных заболева­ ний, и прежде всего бронхиальной астмы. Антагонисты М-холинорецеп- торов блокируют действие ацетилхолина на фосфолипазу С, снижая тем самым уровень фосфоинозитидного ответа и прироста внутриклеточной концентрации кальция. В экспериментах in vitro на ГМ ВП морской свин­ ки показана эффективность ингибитора фосфолипазы С (U-73122) для снятия сокращения, вызванного антигеном, агонистами мускариновых рецепторов и лейкотриенами (Salari, 1993). Агонисты Р-рецепторов (р) вызывают активацию аденилатциклазы (АС) через выбелок и прирост сАМР. Этот вторичный посредник в свою очередь активирует протеинкиназу A (Prk-A), которая фосфорилирует MLCK, уменьшает ее сродство к комплексу Са4...СаМ. Предполагается также, что протеинкиназа A (Prk- А), фосфорилируя специфический белок фосфоламбан, увеличивает ак­ тивность Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума. Ингибиторы фосфодиэстеразы (PDE) препятствуют быстрому падению уровня сАМР в клетке. Антагонисты кальмодулина препятствуют образованию активной конформации комплекса Са2+ через потенциалуправляемые кальциевые каналы.

55

Слабым местом такого рода схем является то обтоятельство, что они по­ строены, как правило, на основании синтеза данных, полученныхдля раз­ ного типа клеток. Так, например, данные о модификации активности MLCK протеинкиназой А в наиболее полной мере разработаны только для гладкой мускулатуры желудка птиц. Сведения об участии протеинкиназы А в регуляции активности Са2+-насоса саркоплазматического ретикулума получены на кардиомиоцитах. Данные о кинетических характеристиках формирования фосфоинозитидного ответа ГМК ВП ограничены единич­ ными сообщениями. Это замечание особенно существенно при анализе путей фармакологической коррекции активности ГМК, характеризующих­ ся крайне высокой тканевой и видовой специфичностью. Следует особо отметить, что именно знание особенностей принципов функционирова­ ния клеток специализированной ткани позволяет создать тропные к ней фармакологические препараты, обладающие минимумом побочных дей­ ствий. Поясним это на примере прогресса, достигнутого в последние годы при выяснении механизма действия имеющихся бронхолитиков и созда­ ния новых лекарственных препаратов.

ГМК ВП большинства млекопитающих, в том числе и человека - из распространенных экспериментальных животных исключение составля­ ет морская свинка - лишены спонтанной электрической активности и ос­ цилляций мембранного потенциала, вызванного распространением потен­ циала действия. Это означает, что, несмотря на существование в ГМК ВП медленных (L-типа) потенциалуправляемых Са2+-каналов (это положение подтверждено в экспериментах по связыванию меченых Са2+-антагонис- тов), такие каналы не будут вносить существенного вклада в общую вели­ чину входящего потока кальция за счет сохранения мембранного потен­ циала на уровне, обеспечивающем поддержание этих каналов в закрытом состоянии. Кроме того, известно,что сродство Са2+-каналов L-типа к каль­ циевым антагонистам (производные дигидропиридинов и фентоламинов) при нормальных значениях мембранного потенциала относительно неве­ лико и резко возрастает в условиях деполяризации. По всей видимости, именно этим и объясняется тот факт, что в отличие от патологий сердеч- но-сосудистой системы и, в частности, гипертонической болезни, орга­ нические антагонисты кальция (производные верапамила, дилтиазема и дигидропиридинов) не получили широкого распространения в терапии бронхиальной астмы (Barnes, 1992).

В этой связи особое внимание привлекают исследования, посвящен­ ные механизмам регуляции потенциала сарколеммы ГМК ВП. Имеющи­ еся данные свидетельствуют о том, что решающая роль в этом процессе принадлежит высокой калиевой проводимости. Так, было обнаружено, что

56

антагонисты К+-каналов (харибдотоксин, ибериотоксин, тетраэтиламмоний) вызывают деполяризацию, которая в свою очередь активирует потенциалуправляемые Са2+-каналы. Вход кальция через них в дополнение к выбросу кальция из внутриклеточных депо приводит к поддержанию внутриклеточной концентрации кальция на высоком уровне и сокраще­ нию ГМК ВП (Morthan, 1989).

ВГМК ВП обнаружено три типа К+-каналов:

1)потенциалуправляемые К+-каналы (Kotlikoff,1993),

2)К+-каналы, активируемые при повышении концентрации внутрикле­ точного кальция: малой проводимости (ингибируются апамином), сред­ ней и большой проводимости (ингибируются харибдотоксином — ChTX, ибериотоксином) (Yamauchi, 1994),

3)К+-каналы, время нахождения которых в открытом состоянии резко возрастает при падении внутриклеточной концентрации АТФ, ингибиру­ ются глибенкламидом (glibenclamide) и активируются никорандилом (nicorandil), кромокалимом (cromocalim), пинацидилом (pinacidil) и апикалимом (apicalim или соединение RP 52891) (Escande,1992).

Основную роль среди этих функционально различных К+-каналов иг­ рают Са2+-зависимые каналы большой проводимости. Их ингибирование вызывает сокращение ГМК ВП. В настоящее время известно также, что эти каналы вовлечены в регуляцию тонуса ГМ ВП при действии р-агони- стов и М-холинолитиков.

Следующие данные свидетельствуют о том, что действие Р-рецепторов

исистемы сАМР связано с активностью Са2+-зависимых К+-каналов боль­ шой проводимости, содержание которых в ГМК ВП наиболее велико.

Действие Р-агонистов, каталитической субъединицей протеинкиназы А и Gs на К+-проводимость наблюдалось только при наличии в растворе, омывающем внутреннюю поверхность мембраны микромолярных концен­ траций Са2+ (Ките, 1992).

Расслабляющее действие умеренных концентрации Р-агонистов на то­ нус ГМК ВП морской свинки и человека, предварительно обработанных ацетилхолином, уменьшалось в присутствии ChTX, но не ингибиторов АТФ-чувствительных К+-каналов или апамина (ингибитора Са2+-активи- руемых К+-каналов малой проводимости (Miura, 1992).

Вэтих же работах установлено, что ингибирующий эффект ChTX осла­ бевал по мере увеличения концентрации Р-агониста, был относительно не­ велик при использовании ингибиторов фосфодиэстеразы и не был отме­ чен, когда расслабление ГМК осуществлялось за счет введения активато­ ра АТФ-чувствительных К+-каналов. На основании этих данных можно заключить, что в ГМК ВП расслабляющее действие агонистов Р-рецепто-

57

ров опосредовано через открытие К+-каналов и гиперполяризацию сар­ колеммы, что приводит к снижению поступления кальция как через ион­ ные каналы, так и через систему электрогенного С а 2+/ № +-о б м е н а . в от­ личие от ГМК ВП, в ГМК сосудов расслабляющий эффект сАМР-сигналь- ной системы опосредован через прямое ингибирующее действие этого посредника на Са2+-каналы L-типа (Orlov, Tremblay, Hamet, данные подго­ тавливаются к публикации), что создает предпосылки для создания тка­ неспецифичных лекарственных препаратов.

Таблица 1

Влияние изопреналина, каталитической субъединицы протеинкиназы А и окадевой кислоты на кинетические характеристики К+-каналов гладкой мускулатуры трахеи кролика (Ките, 1989)

Вэкспериментах по регистрации одиночной проводимости каналов

*было установлено, что (i-агонисты увеличивают вероятность нахождения К+-каналов в открытом состоянии. Этот эффект модулировался добавле­ нием каталитической субъединицы протеинкиназы А и ингибитора фосфопротеинфосфатаз - окадевой кислоты (табл.1). Позднее было установ­ лено, что увеличение К+-проводимости наблюдается после добавления не­ гидролизуемых аналогов ГТФ, которые потенцируют действие Р-агонис- тов, что указывало на участие в этом процессе ГТФ-связывающих белков.

Всамом деле, открытие К+-каналов наблюдалось при добавлении Gs или его субъединицы в комплексе с ГТФ, но не ГДФ (Ките, 1992). В настоя­ щее время установлено, что гиперполяризующее действие агонистов Р- рецепторов может осуществляться по двум независимым друг от друга пу­ тям, связанным как с активацией аденилатциклазы, протеинкиназы А и фосфорилированием неидентифицированного белка или, возможно, не­ посредственно каналоформера, так и с непосредственным стимулирую-

58

щим действием а-субъединицы выбелка на К+-каналы, так называемый “membrane-limited” механизм (Ките, 1994).

Высвобождение ацетилхолина из нервных окончаний парасимпатичес­ кой нервной системы играет центральную роль в сокращении гладкомы­ шечных клеток, в том числе и ВП. Тем не менее, как уже отмечалось выше, последовательность событий, приводящих к сокращению ГМ ВП при ак­ тивации М-холинорецепторов, до сих пор не установлена

Было выявлено, что ацетилхолин, действуя через М-холинорецептор, уменьшает время нахождения Са2+-активируемых К+-каналов в открытом состоянии. Действие агониста М-холинорецепторов усиливалось в при­ сутствии ГТФ и блокировалось ГДФ, а также коклюшным токсином (Ките, 1992). Известно, что при действии коклюшного токсина происходит АДФрибозилирование целого семейства G-белков, отличающихся своей а - субъединицей (так называемые G^, Gm и Gat ГТФ-связывающие белки). Тем не менее ни а , ни а о субъединицы не вызывают ингибирования Са2+- активируемых К+-каналов ГМК ВП (Ките, 1992). Трудно предположить, что в этот процесс вовлечена a t субъединица, до сих пор обнаруживаемая только в наружных сегментах палочек сетчатки. В этой связи можно пред­ положить, что действие М-холинолитиков на Са2+-активируемые К+-ка- налы либо опосредовано через новый класс a -субъединиц, чувствитель­ ных к коклюшному токсину, либо в этом взаимодействии участвуют также Р~ и у-субъединицы.

Приведенные здесь сведения позволяют предположить следующую схе­ му регуляции Са2+-зависимых К+-каналов при действии агонистов р-ад- рено- и М-холинорецепторов. Агонисты М-холинорецепторов приводят к высвобождению кальция из внутриклеточных депо и входу кальция че­ рез рецептороперируемые каналы, открываемые либо в ответ на повыше­ ние Са2+., либо за счет продукции 1Р4. Открытие низкоселективных рецептороперируемых Са2+-каналов стремится вызвать деполяризацию мемб­ раны. Деполяризация мембраны препятствует выходу калия через кана­ лы, открывающиеся в ответ на повышение [Са2+],. Сравнительно недавно это было убедительно продемонстрировано нами в экспериментах на эри­ троцитах человека и полосках гладкой мускулатуры мочеточника, где транзиторный гиперполяризационный ответ также связан с активацией К+- каналов (Баскаков, 1989). Как уже отмечалось выше, сарколемма ГМК ВП обогащена высокопроводящими Са2+-активируемыми К+-каналами, бло­ кируемыми ChTX, которые препятствуют деполяризации мембраны и вхо­ ду кальция через рецепторуправляемые каналы, блокируемые органичес­ кими антагонистами кальция. Тем не менее такая возможность, по-види­

59