6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Гематология_Национальное_руководство

образованию плотного фибринового сгустка, который укрепляет необратимый тромбоцитарный агрегат.

Сократительные реакции тромбоцитов в тромбоцитарно-фибриновой гемостатической пробке приводят к ее ретракции, что еще более повышает прочность этой структуры. В результате у здорового человека гемостатическая пробка может противостоять повышенному кровяному давлению после восстановления кровообращения в поврежденных сосудах среднего размера, которое наступает обычно через 2 ч. Таким образом, на этой стадии осуществляется окончательный, или вторичный, гемостаз.

При повреждении мелких сосудов, где нет существенного давления крови,сосудисто-тромбоцитарные реакции обеспечивают не только первичный, но и окончательный гемостаз. Фибринообразование в данном случае не является условием окончательной остановки кровотечения. Вследствие этого при проведении теста первичной длительности кровотечения, когда производится дозированное стандартное повреждение мелких сосудов (артериол и капилляров), создается возможность по времени кровотечения оценивать эффективность только сосудисто-тромбоцитарных реакций.

Необходимо остановиться на основных биохимических и молекулярных процессах, которые наблюдаются в ходе активации тромбоцитов и определяют осуществление тромбоцитарных функциональных реакций. Без понимания этого невозможно адекватно интерпретировать результаты исследований в норме и при патологии, характеризовать основные механизмы нарушений тромбоцитарного гемостаза в патологических условиях. Как отмечалось выше, в интактном состоянии тромбоциты не взаимодействуют ни с интактными стенками сосудов, ни с другими клетками крови. В активированном состоянии - после связи с субэндотелиальными структурами и стимулирующими субстанциями зоны повреждения - тромбоциты очень быстро приобретают способность взаимодействовать с поврежденными сосудистыми стенками, с клетками крови, друг с другом. Началом перехода из одного состояния в другое служит действие на специфические рецепторы тромбоцитов субстанций, экзогенных для этих клеток в нормальной циркуляции, - так называемых агонистов. Агонисты, как правило, не могут проникать через тромбоцитарную мембрану, но способны взаимодействовать со специфическими рецепторами их плазмалеммы. Агенты, активирующие тромбоциты, представлены двумя группами:

1)нерастворимые адгезивные белки субэндотелия, с которыми тромбоциты могут вступать в контакт после повреждения эндотелия и при более глубоком повреждении тканей;

2)естественные растворимые агонисты, имеющиеся в поврежденных тканях или генерируемые при стимуляции клеток.

Первая группа активных агентов инициирует адгезию тромбоцитов. Адгезия по своему механизму является сложным процессом, который начинается, когда тромбоциты вступают в контакт с чужеродной для них поверхностью субэндотелия.

Медицинские книги

@medknigi

Врезультате взаимодействия специфических тромбоцитарныхрецепторов адгезии со структурами субэндотелиального матриксатромбоциты активируются, изменяют свою форму и прилипают к этим структурам. Это завершается необратимой адгезией, или распластыванием на субстратной поверхности. В фазе распластывания резко увеличивается площадь контакта и степень молекулярных взаимодействий тромбоцитов с субэндотелием, что делает прочной фиксацию этих клеток и тромбоцитарных агрегатов на поврежденных тканях стенки сосуда.

Внормальном организме поврежденная стенка сосуда богата адгезивными белками экстрацеллюлярного матрикса, и прежде всего коллагеном, различные типы которого существенно различаются по своей реактивности к тромбоцитам. Из других адгезивных белков субэндотелия следует назвать фактор Виллебранда(фВ), фибронектин, витронектин, ламинин и тромбоспондин. На экспозированных поврежденных тканях из плазмы адсорбируется также фибриноген. Взаимодействие с коллагеном и другими адгезивными белками субэндотелия медиируется несколькими тромбоцитарными гликопротеиновыми (GP) рецепторами: GPIa-IIa, GPVI, GPIV, GPIIb-IIIа и другими интегринами, а в случае связи, опосредованной фактором Виллебранда, - комплексом GPIb-IX-V и также GPIIb-IIIа. В патологических условиях к реактивным поверхностям могут быть отнесены патологически измененный эндотелиальный слой, атеросклеротические бляшки, искусственные клапаны сердца и сосудистые шунты.

Прилипание кровяных пластинок к субэндотелиальным структурам, прежде всегок

коллагену, по своему механизму различается в зонах циркуляции с малой скоростью тока (и низким напряжением сдвига) и большой скоростью тока крови (и высоким напряжением сдвига). При низком напряжении сдвига (в случае повреждения стенок крупных артерий, вен) тромбоциты присоединяются к коллагену и фибронектину непосредственно через экспрессируемые GPIa-IIa и GP VI. При высоком напряжении сдвига (при повреждении мелких артерий и артериол) адгезия кровяных пластинок к коллагену опосредована высокомолекулярным (до 20 млн Да) кофактором адгезии (фВ). В зоне повреждения этот кофактор находится вместе с другими адгезивными протеинами в субэндотелии. Плазменный фВ не может непосредственно взаимодействовать с кровяными пластинками без предварительной его активации, так как в нем не экспозированы места связи с тромбоцитарными рецепторами. Но в рассматриваемых условиях повреждения в зоне высокого напряжения сдвига крови под влиянием гемодинамических сил и контакта с субэндотелием фактор Виллебранда из плазмы подвергается конформационным изменениям, в нем экспозируются соответствующие домены связи - с тромбоцитарным GPIb-IX-V и с коллагеном. В результате он соединяется, с одной стороны, с коллагеном, а с другой, - с названным тромбоцитарным рецептором. В последнем (в GPIbα) под влиянием высокого напряжения сдвига или первичного контакта тромбоцитов с коллагеном, по-видимому, также становятся доступными места связи с фВ. Таким образом формируется «ось

адгезии»: коллаген - плазменный фВ-GPIb. Возможно соединение кровяных пластинок и непосредственно с фВ, находящимся в субэндотелии (в котором места связи с GPIb

Медицинские книги

@medknigi

доступны без дополнительной активации), в этом случае «ось адгезии» двухчленная: субэндотелиальный фВ-GPIb.

Фаза обратимой агрегации тромбоцитов.

Процесс активации тромбоцитов, кроме взаимодействия с адгезивными белками субэндотелиального матрикса, вызывается и всеми появляющимися в зоне повреждения естественными растворимыми агонистами, каждый из которых имеет на мембране свой специфический рецептор или несколько рецепторов. К растворимым агонистам относятся, например, аденозиндифосфат, серотонин, адреналин, PAF, тромбоксан А2 и лабильные простагландины, выделяемые из тромбоцитов; PAF и ADP - из активированных клеток эндотелия и поврежденных тканей сосудистой стенки; ADP - из эритроцитов, которые в зоне повреждения подвергаются микрогемолизу. Агрегация индуцируется также первыми малыми количествами сильнейшего активатора тромбоцитов - тромбина, который генерируется на поверхности клеток субэндотелия и активированного эндотелия, экспрессирующих тканевой фактор. Растворимые агонисты связываются со своими рецепторами на поверхности тромбоцитарной мембраны, и в результате этого в процесс агрегации вовлекается все большее число тромбоцитов, поступающих с кровью в зону повреждения. Тромбоциты могут активироваться и агрегировать также вследствие действия на их мембрану гемодинамических сил движущейся крови в зоне с высоким напряжением сдвига, в особенности в местах патологического сужения сосудов и при возникновении турбулентного тока крови.

Мембранные взаимосвязи и воздействия на мембрану вызывают серию передач сигналов активации: прежде всего к интегрину GPIIb-IIIa, который опосредует агрегацию тромбоцитов, а также через мембрану и цитоплазмувнутрь клетки, в итоге чего стимулируются внутриклеточные субстанции и структуры, осуществляющие непосредственно ее финальные реакции. В результате передачи мембранного сигнала активации развивается доступностьосновного рецептора агрегационной реакции, GPIIb-IIIa, которая обусловлена конформационными изменениями молекулы данного комплекса с экспозицией мест связи для фибриногена и других адгезивных белков. После этогофибриноген, который является симметричной молекулой, в присутствии ионовСа2+ связывается с рецепторами GPIIb-IIIa двух близлежащих тромбоцитов. Содействуют соединению тромбоцитов друг с другом, как и адгезии к субэндотелиальным структурам, образующиеся в это время их многочисленные отростки - филоподии. Необходимое для осуществления этих

связейстолкновение отдельных пластинок происходит в условиях тока крови в организме или в перемешиваемой плазме в агрегометре.

Итак, в результате мембранной активации на ранних фазах тромбоцитарного гемостаза последующее обеспечение доступности мембранного рецептора GPIIbIIIa служит необходимым условием развития фазы агрегации. Здесь проявляется закономерность последовательного развития фаз благодаря тому, что

Медицинские книги

@medknigi

биохимические и молекулярные изменения любой из них создают предпосылки для развития последующих.

Фаза тромбоцитарной секреции и вторичной необратимой агрегации.Адгезия

ипервичная агрегация с образованием относительно малого числа небольших и непрочных агрегатов - это только начальные ступени в цепи гемостатических реакций тромбоцитов, и они сами по себе не способны обеспечить эффективный гемостаз. Однако практически все мембранные изменения в период адгезии и обратимой агрегации связаны с передачей сигнала не только на GPIIb-IIIa, но

ивнутрь клетки. Начало передачи сигнала через мембрану осуществляется с помощью системы так называемых G-протеинов, т.е. белков, связывающих гуанозинтрифосфат. В тромбоците имеется несколько взаимосвязанных путей внутриклеточной трансмиссии сигналов активации: простагландин-

тромбоксановый путь, полифосфоинозитидный, тирозинкиназный. В каждом из этих путей в результате сигнального стимула в мембране развивается последовательный ряд ферментативных реакций с образованием вторичных передатчиков - мессенджеров. При этом в клетке повышается уровень свободного цитоплазматического Са2+, который является главным биорегулятором ферментативных реакций во всех путях передачи сигналов активации и конечных эффектов.

Как было установлено в 60-х годах прошлого столетия, тромбоциты являютсясекреторными клетками. Они содержат в гранулах хранения активные подлежащие секреции субстанции, которые обеспечивают выполнение этими клетками в организме ряда важнейших гемостатических и других защитных функций. Гранулы отличаются по содержанию хранимых в них активных субстанций и силе, необходимой для индуцирования высвобождения последних. Секреция из плотных телец и α-гранул может быть индуцирована как сильными, так и слабыми агонистами, осуществляется через 1-2 мин на 100%. Секреция из лизосомальных гранул вызывается после действия сильных агонистов, протекает медленнее - в течение нескольких минут - и завершается опустошением гранул только на 60%.

Тромбоциты имеют и механизмы осуществления секреторного процесса, а именно пути передачи сигналов стимуляции, приводящие к активацииактомиозиновой системы, что завершается сократительной реакцией с выделением (экструзией) по каналам открытой канальцевой системы в окружающую среду многочисленного содержимого гранул хранения. Сокращение тромбоцитарного актомиозина обеспечивает не только сам акт высвобождения, но и сближение тромбоцитов в агрегате (т.е. консолидацию тромбоцитарной пробки и ретракцию фибринового сгустка, что необходимо для окончательного гемостаза).

Механизмы передачи сигналов активации внутрь клетки к системам, реализующим ее финальные функциональные реакции, в том числе и секреторные, достаточно сложны и различны для слабых и сильных агонистов. К сильным агонистам относятся тромбин и коллаген в больших дозах. Эти агонисты после соединения со

Медицинские книги

@medknigi

своими рецепторами и связи с соответствующими G-протеинами мембраны способны активировать фосфолипазу С и включать таким образом полифосфоинозитидный путь передачи сигнала стимуляции, который завершается активацией протеинкиназы С и генерацией ионофора инозитолтрисфосфата (IP3). Обе конечные линии данного пути создают необходимые основные условия для стимуляции сократительной системы тромбоцитов, вызывая соответственно через РКС фосфорилирование белков этой системы, а через IP3 - повышение уровня свободного цитоплазматического Са2+(Саi2+).

Необходимо подчеркнуть, что взаимодействие с рецепторами тромбоцитарной мембраны так называемых слабых агонистов (AДФ, серотонина, эпинефрина и малых доз коллагена и тромбина) дает недостаточно сильный сигнал для описанной прямой стимуляции сокращения актомиозина. Поэтому при действии слабых агонистов для полной эффективной активации требуются дополнительные реакции с включением положительных обратных связей, усиливающих первичный сигнал после развития обратимой агрегации. Эти дополнительные реакции связаны прежде всего с простагландин-тромбоксановым путем передачи сигнала активации.

Изменения, вызываемые в плазматической мембране при взаимодействии рецепторов с естественными слабыми агонистами и при последующем контакте мембран в процессе первичной агрегации, приводят к активации мембранной фосфолипазы А2. Мембранная фосфолипаза А2, в свою очередь, индуцирует цепь реакций простагландин-тромбоксанового пути, который начинается с высвобождения из мембранных фосфолипидов арахидоновой кислоты и приводит к образованию таких активных продуктов, как лабильные простагландины (PGG2, PGH2) и особенно тромбоксан А2. Последний является короткоживущим и очень сильным вазоконстриктором и эндогенным агонистом. Выделяясь из тромбоцитов и связываясь с рецепторами плазматической мембраны (как данной клетки, так и других кровяных пластинок, приносимых током крови), тромбоксан А2, PGG2, PGH2осуществляют первую положительную обратную связь, т.е. рекрутируют дополнительное число фибриногеновых рецепторов, расширяют плацдарм агрегации, а также усиливают сигнал активации, передаваемый к внутренним эффекторным структурам клетки. Большое значение имеет и способность тромбоксана А2после соединения его с рецепторами плазмалеммы стимулировать фосфолипазу С и полифосфоинозитидный путь активации,

завершающийся фосфорилированием сократительных белков. Именно это наиболее существенно, поскольку сам образовавшийся в клетке тромбоксан непосредственно данные реакции не вызывает.

Итак, на конечном этапе передачи сигнала активации, благодаря сокращению тромбоцитарного актомиозина, индуцируемого как сильными агонистами, так и более длинным путем слабыми агонистами, осуществляется ряд финальных реакций, из которых наиболее важными являются два следующих эффекта.

Медицинские книги

@medknigi

1.Так как актомиозиновые филаменты пересекают всю цитоплазму тромбоцита и с внутренней стороны мембраны связаны с теми же трансмембранными гликопротеинами IIb - IIIa, с которыми с наружной стороны соединены межтромбоцитарные фибриногеновые/фибриновые мосты связи, сокращение актомиозина в каждой пластинке, включенной в тромбоцитарно-фибриновую сеть, приводит к сокращению системы в целом. В результате это приводит куплотнению (консолидации) тромбоцитарных агрегатов и ретракции

тромбоцитарно-фибринового сгустка.

2.Сокращение актомиозина является и механизмом осуществления секреторных реакций. Механизм высвобождения из гранул хранения обусловлен тем, что при сокращении актомиозиновых волокон, связывающих в разных направлениях цитоплазматические концы трансмембранных гликопротеинов IIb - IIIa внутри клетки на противоположно расположенных ее сторонах, происходит повышение внутриклеточного давления, передвижение гранул, сближение и слияние их мембран с мембранами открытой канальцевой системы и плазматической мембраной и, наконец, выброс (экструзия) через эти места содержимого гранул в каналы открытой канальцевой системы и в окружающую среду. Последнее приводит к развитию второй волны агрегации (вследствие высвобождения эндогенных агонистов) и обеспечивает ее необратимость (в результате высвобождения адгезивных белков, укрепляющих фибриногеновые связи). Но функциональные последствия секреции значительно шире, и они определяются характером содержимого различных гранул хранения.

Из плотных телец (δ-гранул) высвобождаются гемостатически активные субстанции, необходимые для усиления в зоне сосудистого повреждения вазоспазма (эпинефрином, серотонином), а также активации и агрегации тромбоцитов. В результате секреции AДФ, серотонина, эпинефрина и после их связи с соответствующими мембранными рецепторами реализуется важнейшая вторая положительная обратная связь, которая вместе с первой делает возможной развитие вторичной агрегации при действии слабых агонистов. Здесь нужно отметить, что третья обратная связь тромбоцитарной активации (хотя по важности она не является последней) осуществляется через первые малые количества сильнейшего тромбоцитарного активатора - тромбина, генерируемого в зоне повреждения при инициирующем эффекте тканевого фактора стимулированных моноцитов и клеток стенки сосуда (эндотелиоцитов, макрофагов, фибробластов). Из γ-гранул (лизосом) высвобождаются лизосомальные энзимы, принимающие участие в реканализации сосуда после завершения гемостаза.

Из α-гранул секретируется более 50 протеинов, которые играют большую роль не только в гемостатических реакциях, но и в других физиологических и патологических процессах организма. Можно назвать следующие группы активных секретируемых субстанций. Коагуляционные протеины(тромбоцитарный фибриноген, фактор V, высокомолекулярный кининоген), антифибринолитические компоненты (α2-антиплазмин, PAI-1) и ряд субстанций

сантикоагулянтными свойствами (α2-макроглобулин, α1-ингибиторный протеин,

Медицинские книги

@medknigi

ингибитор фактора XIa, протеин S, нексин II, TFPI). Все они тем или иным способом принимают участие в процессе свертывания крови и его регуляции. Адгезивные протеины (фибриноген, фВ, тромбоспондин, фибронектин, витронектин, богатый гистидином гликопротеин) участвуют в дальнейшем развитии необратимой адгезии и укреплении фибриногеновых связей агрегировавших тромбоцитов.Факторы, стимулирующие рост, и прежде всего так называемый выделяемый тромбоцитами фактор роста, весьма важны для репарации поврежденных стенок сосудов, а в патологических условиях принимают участие в развитии атеросклероза.

Итак, на основании изложенного понятно, почему рассмотренную фазу агрегации называют вторичной (в основе ее лежит высвобождение из тромбоцитов эндогенных агонистов, вызывающих более позднюю агрегационную реакцию) инеобратимой (в результате ее тромбоциты не могут отделяться от агрегата, поскольку они максимально сближены вследствие сокращения актомиозиновых структур, а фибриногеновые/фибриновые связи укреплены адгезивными протеинами, секретированными из α-гранул). Фазу вторичной агрегации обозначают также фазой секреции и необратимой вторичной агрегации, так как секреторные реакции достигают в это время своей кульминации и являются основой развития этой фазы.

Участие плазменных компонентов в гемостазе

Для осуществления механизма окончательного гемостаза, а именно для образования вторичной гемостатической пробки, важен процесс свертывания крови. В этом процессе принимают участие факторы свертывания крови, синтез которых происходит в паренхиматозных клетках печени (табл. 8.1).

В интактном сосуде факторы свертывания (прокоагулянты) циркулируют в неактивной форме. Повреждение сосудистой стенки, как и в случае с тромбоцитами, сопровождается последовательной активацией факторов свертывания крови. В результате образуются два основных компонента коагуляционного гемостаза - тромбин и фибрин, которые стабилизируют первичную тромбоцитарную пробку и таким образом способствуют окончательному гемостазу.

На основании изучения функции и взаимодействия факторов свертывания крови в 1964 г. была предложена, так называемая каскадная модель процесса свертывания крови. Основное внимание в каскадной модели свертывания крови было уделено структуре коагуляционного процесса как серии протеолитических реакций, в результате которых факторы свертывания крови трансформируются в свою активную форму. При этом клеточные компоненты, на которых происходит композиция энзиматических комплексов, рассматривались как источник анионных фосфолипидов. Согласно каскадной модели, активация коагуляционных факторов, приводящая к образованию тромбина и фибрина, осуществляется двумя путями - внешним и внутренним, в зависимости от характера активирующей поверхности на начальных этапах процесса свертывания крови (рис. 8.1). Для внешнего пути такой

Медицинские книги

@medknigi

поверхностью является тканевый фактор (ТФ). Контакт с ТФ происходит после повреждения эндотелия, поскольку он находится в субэндотелиальных структурах (отсюда название - внешний путь). Для внутреннего пути требуется поверхность активированных тромбоцитов. Последние являются составными частями крови

(отсюда название - внутренний путь). Отличительной особенностью внешнего и

внутреннего путей активации свертывания крови является участие различных прокоагулянтов в образовании протромбиназы, которая представляет собой комплекс из активированных факторов Ха и Vа.

Как видно из представленной каскадной модели свертывания крови, образование протромбиназы по внешнему пути запускается ТФ, который в комплексе с фактором VIIa и при участии ионов кальция активирует фактор Х. Внутренний путь образования протромбиназы начинается с активации фактора XII при контакте крови с субэндотелиальными компонентами сосудистой стенки, в частности с коллагеном. Процесс активации фактора XII усиливается калликреином. В последующем XIIa при участии высокомолекулярного кининогена трансформирует фактор XI в активную форму, который, в свою очередь, активирует фактор IX. Далее активные формы факторов IX и VIII на поверхности активированных тромбоцитов образуют теназный комплекс, который непосредственно трансформирует фактор Х в Ха. С момента образования фактора Ха и далее протромбиназы (комплекс факторов Ха/Va) процесс свертывания крови протекает по общему пути с неизменным набором факторов.

Таблица 8.1. Плазменные факторы свертывания крови♠

* Зубаиров Д.М. Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования. - Казань: Фэн,

2000. - С. 324-325.

Медицинские книги

@medknigi

свертывающей системы крови. Именно факт локализации различных коагуляционных факторов на поверхностях субэндотелиальных клеток и тромбоцитов позволил по-новому пересмотреть последовательность включения их в процесс формирования фибринового сгустка.

С учетом данных о локализации и контроле коагуляционных реакций на различных клеточных поверхностях процесс свертывания крови может быть представлен в виде трех перекрывающих друг друга фаз (рис. 8.2 на цветной вклейке).

1-я фаза - инициация свертывания крови, формирование стартового сигнала к активации процесса коагуляции, развивается в тот момент, когда в результате повреждения целостности сосудистой стенки происходит обнажение и контакт с кровью субэндотелиальных клеток, имеющих специфический интегральный белок

-ТФ. Тканевый фактор экспрессируется во многих типах клеток, не контактирующих с кровью, в том числе в гладкомышечных, фибробластах, макрофагах. При нормальных условиях большинство клеток, находящихся в прямом контакте с кровью, лишены TФ. В их число входят эндотелиальные клетки кровеносных сосудов и тромбоциты. В патологических условиях, например при воспалении, в моноцитах/макрофагах и в эндотелиальных клетках синтез TФ может быть индуцирован липополисахаридами эндотоксина, иммунными комплексами, тромбином, рядом цитокинов, окисленными липопротеинами низкой плотности и даже механическим изменением тока жидкости около них. Эти данные позволяют рассматривать ТФ как важный фактор патогенеза многих заболеваний. Исключительным свойством ТФ является его способность связываться с фактором VII с образованием комплекса ТФ/VII. Важно отметить, что, в отличие от других прокоагулянтов, циркулирующих в крови в неактивной форме, у здорового человека от 0,01 до 1% всего количества фактора VII присутствует в кровотоке в активированной форме VIIa. Экспозиция ТФ приводит к образованию активного комплекса ТФ/VIIа, а также комплекса ТФ/VII. В последнем фактор VII превращается в VIIa за счет активации комплексом ТФ/VIIа и под действием фактора Xa. Весьма важно, что один фактор VIIa без ТФ обладает очень низкой протеолитической активностью, которая на несколько порядков усиливается в присутствии кофактора

-ТФ. Поскольку ТФ является интегральным мембранным белком, комплекс ТФ/VIIа всегда будет связан с мембранной поверхностью клеток. Это очень важный момент, который объясняет локализацию коагуляционного каскада в зоне повреждения сосуда, т.е. именно в том месте, где он необходим для остановки кровотечения. Активный комплекс ТФ/VIIа путем ограниченного протеолиза активирует факторы Х и IX. При этом образовавшийся фактор IXa как бы «соскальзывает» с поверхности субэндотелиальных клеток, несущих ТФ, и взаимодействует со специфическим рецептором на активированных тромбоцитах, которые находятся в непосредственной близости в зоне повреждения сосуда.

Фактор Ха, оставаясь на поверхности субэндотелиальных клеток, вместе со своим кофактором (фактором Va) образует протромбиназу. Протромбиназа протеолитически расщепляет протромбин, в результате чего образуется тромбин.

Медицинские книги

@medknigi