2 курс / Гистология / Основы_гистологии_УЧЕБНО_МЕТОДИЧЕСКОЕ_ПОСОБИЕ_1

Всовременной гистологии значительный дополнительный объем информации о гистологическом объекте можно получить при помощи количественных методов. Наиболее простым количественным гистологическим исследованием является подсчет гистологических структур в поле зрения микроскопа или на единицу площади среза. К морфометрическим методам относится также определение размеров гистологических объектов с помощью окулярмикрометра — специальной микролинейки, вставленной в окуляр микроскопа. С морфометрической целью используются и морфо-метрические сетки. На этих сетках имеются точки (узлы). Так, например, наиболее часто используемая морфометрическая сетка Г.Г. Антандилова представляет собой прямоугольник, разделенный на два квадрата. Один из квадратов разделен на 4 более мелких квадрата. В каждом из этих малых квадратов имеется по 25 точек (всего 100 точек). Неразделенный большой квадрат содержит 25 точек. При помощи морфометрической сетки можно определить объемные доли различных структур в гистологическом объекте. Для этого случайным образом накладывают сетку определенное число раз на срез ткани или органа в гистопрепарате и подсчитывают количество точек, выпадающих на различные структуры. Предположим, в препарате соединительной ткани 10 точек выпало на клетки, а на межклеточное вещество пришлось 90 точек. Следовательно, объемная доля межклеточного вещества 90%, а клеток — 10%. Все эти виды морфометрии называются ручной

морфометрией.

Внастоящее время существуют достаточно сложные приборы, которые позволяют автоматически производит!) количественные гистологические и гистохимические исследования. Это так называемые автоматизированные системы анализа изображений (АСАИз). В их состав входят:

сканирующий световой или электронный микроскоп; видеокамера, которая осуществляет просмотр объекта по двум координатам, а затем следует преобразование его в цифровую форму; ЭВМ, которая обрабатывает полученную цифровую информацию и представляет данные о характеристиках исследуемого объекта. С помощью светового дисплея исследователь имеет возможность выделить только интересующие его структуры и получить о них цифровую информацию в виде гистограмм и т.д.

ЦИТОСПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

Это метод изучения химического состава клетки. Он основан на избирательном поглощении теми или иными веществами лучей с определенной длиной волны. По интенсивности поглощения (она зависит от концентрации вещества в клетке) определяют содержание этого вещества.

ЦИТОСПЕКТРОФЛУОРИМЕТРИЯ - это метод количественного изучения веществ в клетке по спектрам их флуоресценции.

ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА

Гистологическая техника — это техника приготовления гистологического препарата.

Гистологическим препаратом может быть срез органа, ткани, мазок, отпечаток, пленочный препарат, культура тканей. Во всех случаях гистологический препарат должен отвечать таким требованиям:

1.Быть прозрачным, т.е. пропускать поток света. Для этого изготавливают достаточно тонкие срезы органов, тканей, клеток.

2.Быть контрастным, что достигается окрашиванием препарата.

https://t.me/medicina_free

3. Быть постоянным, т.е. сохраняться длительное время и служить в качестве своеобразного документа.

Все эти требования к гистологическому препарату и выполняются в ходе гистологической техники.

Гистологическая техника включает в себя несколько этапов: 1. Взятие материала:

—во время операции;

—от трупов;

—от экспериментальных животных;

—путем пункционной биопсии;

—взятие крови, красного костного мозга путем пункции;

—приготовление отпечатков (с полости рта, влагалища и др.). 2. Фиксация материала.

Фиксация полученного гистологического материала — это воздействие на него химическими веществами, а также физическими факторами, что препятствует дальнейшему разрушению тканей объекта, сохраняет его структуру. Физические фиксирующие факторы — замораживание (твердой углекислотой, в жидком азоте, кислороде и т.д.), воздействие высокой температуры, рентгеновское облучение. Все эти факторы вызывают гибель бактерий и инактивируют собственные ферменты тканей, способствуя сохранению гистологического материала. Химические фиксаторы также вызывают гибель микробов и собственных ферментов тканей, стабилизируют структуру объекта. Различают простые и сложные химические фиксаторы. Простые фиксаторы состоят из одного химического вещества (например, формалин, спирт, уксусная кислота и др.). Эти фиксаторы, однако, приводят к определенным нарушениям структуры гистологического материала. Так, формалин вызывает сморщивание его, уменьшение в размерах. Уксусная кислота, наоборот, вызывает набухание. Поэтому чаще применяют сложные фиксаторы, в которых отрицательное действие простых фиксаторов нивелируется. Например, фиксатор ФСУ состоит из 4 частей формалина, 1 части спирта и 0,3 частей уксусной кислоты. Этот фиксатор вызывает весьма незначительные изменения структуры объекта. Известно множество и других сложных фиксаторов.

3. Промывка.

Для вымывания фиксатора из тканей используют воду или другие вещества (спирт).

4. Обезвоживание.

Из объекта удаляют воду путем помещения его в спирты возрастающей концентрации, а затем в хлороформ.

5. Уплотнение материала.

Проводится для того, чтобы из объекта можно было приготовить тонкие срезы. Выполняется путем заливки в парафин, целлоидин или целлоидинпарафин. Можно уплотнить материал и путем замораживания в жидком азоте, что используется в гистохимии ферментов. При этом сохраняются интактными все ферменты.

https://t.me/medicina_free

6. Изготовление срезов.

Этот этап выполняется при помощи приборов МИКРОТОМОВ (рис. 2.8). В них используются очень острые ножи, которые закрепляются неподвижно. Объект, залитый в парафин, движется вперед в течение каждого цикла (оборота) на определенное расстояние (3—10 мкм), и с его поверхности срезаются срезы такой же толщины (ротационный микротом). В микротомах других конструкций (санные микротомы) неподвижно закрепляется объект, а нож движется свободно вперед-назад в горизонтальной плоскости и после каждого цикла движений опускается на заданную толщину, производя срезы.

7. Удаление из срезов парафина.

Срезы помещаются на предметное стекло, подсушиваются и помещаются в растворитель парафина — ксилол, толуол, бензол или в другие вещества.

8. Окрашивание срезов.

При помощи окрашивания достигается контрастность препаратов. Для этого используют красители. В зависимости от источника получения они подразделяются на красители животного, растительного происхождения, синтетические. Кроме того, все красители делятся на кислые (образованы кислотами), основные (образованы основаниями) и нейтральные.

Примером кислого красителя может служить эозин, являющийся синтетическим красителем. Пример основного красителя — гематоксилин. Он получается из коры некоторых пород деревьев (кампешевое дерево).

https://t.me/medicina_free

Красители делятся также на цитоплазматические (окрашивают цитоплазму клетки, например, эозин) и ядерные (окрашивают ядро, например, гематоксилин, азур и др.).

ТИНКТОРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ТКАНЕЙ. Под тинкториальными свойствами понимают способность тканей и клеток окрашиваться красителями. Для обозначения типкториальных свойств используют такие термины:

1.ОКСИФИЛИЯ — это способность клеток и тканей окрашиваться кислыми красителями. Сами структуры при этом имеют основные свойства. Например, эритроциты обладают оксифилией за счет содержания в них основного белка гемоглобина.

2.ЭОЗИНОФИЛИЯ (вариант оксифилии) — способность структур окрашиваться кислым красителем эозином. Эозинофилией обладает цитоплазма многих клеток.

3.АЦИДОФИЛИЯ — то же, что и оксифилия.

4.БАЗОФИЛИЯ — способность структур окрашиваться основными красителями. При этом сами структуры должны иметь кислую реакцию. Например, нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) обладают базофилией, т.к. по химическим законам могут связывать красители-основания. Благодаря этому ядро любой клетки в той или иной степени базофильно. Базофилией обладает также цитоплазма белоксинтезирующих клеток из-за содержащейся в многочисленных рибосомах РНК.

5.ПОЛИХРОМАТОФИЛИЯ — способность структур клетки окрашиваться и кислыми, и основными красителями. Таким качеством обладают, например, гранулы нейтрофильных лейкоцитов. Чаще, однако, в качестве синонима используют термин НЕЙТРОФИЛИЯ.

6.МЕТАХРОМАЗИЯ — способность гистологических структур при связывании красителя изменять его цвет. При этом сами структуры окрашиваются в цвет, который отличается от цвета красителя в растворе. Чаще всего метахромазией обладают углеводные соединения, и появление метахромазии говорит о присутствии в клетке или ткани сложных углеводов.

7.АРГЕНТОФИЛИЯ — способность структур окрашиваться солями серебра.

8.ХРОМОФИЛИЯ — способность структур окрашиваться солями хрома.

9.Заключение, или консервация срезов.

На срез наносят каплю синтетической среды или канадского бальзама, а затем покрывают покровным стеклом. После высыхания бальзама препарат прозрачен, может быть подвергнут изучению под микроскопом, способен долго храниться и может использоваться как своеобразный документ.

ОБРАБОТКА ОБЪЕКТОВ ДЛЯ ТРАНСМИССИОННОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

Обработка гистологических объектов для трансмиссионной электронной микроскопии в принципе состоит из тех же этапов, что и описанная выше гистологическая техника: взятия материала, его фиксации, заливки, изготовления срезов и их окрашивания, или контрастирования. Эти этапы имеют свои особенности. Взятый материал не должен превышать размеры 2 мм (обычно берут кусочек органа кубической формы с длиной ребра 1 мм). Фиксируют полученный материал в некоторых альдегидах (глутаральде-гид) с дополнительной фиксацией (постфиксация) в растворе четырехоки-си осмия. При постфиксации происходит одновременное окрашивание структур.

https://t.me/medicina_free

Заливка материала производится в синтетические (эпоксидные) смолы: аралдит, эпон и др. Изготовление ультратонких срезов толщиной 30—50 им осуществляется на приборе ультратоме при помощи специальных стеклянных или алмазных ножей. При этом вначале на ультратоме готовят полутонкие срезы, на которых (после их окраски) в световом микроскопе находят необходимые для изучения в электронном микроскопе участки. Далее производят "заточку" объекта — удаляют лишние его участки, оставляя необходимые. Затем готовят окончательные (ультратонкие) срезы. Окрашивание (оно называется контрастированием) осуществляют при помощи солей тяжелых металлов (урана, свинца, осмия и др.). Эти соли в разной степени связываются со структурами объекта, что обеспечивает различную электронную плотность (контрастность) последних. После окрашивания ультратонкие срезы помещают на металлическую сетку и затем изучают в электронном микроскопе.

" Для изучения гистологического объекта в сканирующем электронном микроскопе его вначале подвергают фиксации, затем высушивают. Далее на поверхность объекта напыляют металлы, такие, например, как золото, с тем, чтобы они отражали пучок электронов.

Глава 3

ЦИТОЛОГИЯ.

КЛЕТКА КАК СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ЕДИНИЦА ТКАНИ. ОБЩИЙ ПЛАН СТРОЕНИЯ.

ЦИТОПЛАЗМА, СТРОЕНИЕ ОРГАНЕЛЛ И ВКЛЮЧЕНИЙ

Цитология — наука о клетке. Она изучает строение и функции тканевых клеток у многоклеточных организмов, одноклеточные организмы, процессы воспроизводства, роста клеток, их регенерации, приспособления к условиям внешней среды и другие процессы, позволяющие судить об общих для всех клеток свойствах и функциях.

https://t.me/medicina_free

Клетка — это элементарная структурная единица организма, состоящая из ядра, цитоплазмы и ограниченная клеточной оболочкой, способная выполнять все функции, характерные живому: обмен веществ и энергии, размножение, рост, раздражимость, сократимость, хранение генетической информации и ее передачу.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ ТЕОРИИ И ЕЕ ЗНАЧЕНИЕ

Клеточная теория явилась одним из наиболее важных открытий в биологии, перевернувшим существовавшие до нее представления о живой материи. Она дала толчок бурному развитию цитологии, гистологии и эмбриологии и является ее основополагающим учением. Клеточная теория была сформулирована в 1838 году немецкими учеными М. Шлейденом и Т. Шванном, а в дальнейшем развита Вирховым. М. Шлейдеи (1838) создал так называемую теорию цитогенеза, в которой впервые связал возникновение новых клеток не с их оболочкой, а с содержимым и прежде всего с ядром. После этого Т. Шванн (1838) показал, что в явлении цитогенеза скрывается общий принцип развития микроскопических структур всех организмов, позволяющий сделать заключение о принципиальном сходстве клеток всех тканей и органов. Тем самым Т. Шванн обосновал, исходя из генетического принципа, клеточную теорию. Наконец Р. Вирхов в 1859 г. пересмотрел и развил клеточную теорию, выдвинув вместо представлений о цитогенезе положение "всякая клетка из клетки".

Однако разработке клеточной теории предшествовали труды многих ученых. В 1824—1827 гг. французские учение А. Дютроше, Ф. Распайль и П. Тюрпен высказали предположение, что мешочки и пузырьки (т.е. клетки) являются элементарными структурными единицами всех растительных и животных тканей. Особо следует отметить чешского ученого Я. Пуркине, который в определенной степени предвосхитил создание клеточной теории. Он в 1837 г. создал теорию "ядросодержащих зернышек", т.е. клеток. Русский гистолог П.Ф. Горянинов на протяжении 1834— 1847 гг. сформулировал принцип, согласно которому клетка является универсальной моделью организации живых организмов.

В настоящее время главные положения клеточной теории остаются незыблемыми. Однако они существенно дополнены новейшими сведениями о строении клеток, их размножении и гибели, взаимодействии клеток при выполнении своих функций и т.д.

Современная клеточная теория включает такие положения:

1.Клетка является наименьшей единицей живого.

2.Клетки разных организмов имеют похожее строение.

3.Размножение клеток происходит путем деления материнской клетки (omnia cellula e cellule — каждая клетка — из клетки).

4.Многоклеточные организмы состоят из сложных ансамблей клеток и их производных.

Значение клеточной теории состоит в следующем:

1.Она явилась фундаментом для развития многих биологических дисциплин, прежде всего цитологии, гистологии, эмбриологии, физиологии, а также патологии.

2.Позволила понять механизмы онтогенеза — индивидуального развития организмов.

https://t.me/medicina_free

3.Явилась основой для материалистического понимания жизни, окружающего мира.

4.Явилась основой для объяснения эволюции организмов.

СТРОЕНИЕ КЛЕТКИ

Клетка может существовать как самостоятельно, так и в составе тканей многоклеточных животных и растений. В составе тканей клетки являются важнейшим тканевым элементом.

Все клетки делятся па прокариотические и эукариотические.

Прокариота ческие клетки не | имеют ядерной оболочки, не со-*. держат органелл, ядра. Вся гене-

Втическая информация у них хранится в замкнутой в кольцо двойной цепи ДНК. Прокариотические клетки окружены жест-£ кой клеточной стенкой. Они ли-I шены митотического аппарата. К прокариотам относятся некоторые бактерии и водоросли. Все остальные клетки являются эукариотическими. Они отличаются от прокариотов наличием хромосом, системы внутриклеточных мембран, из которых построены органеллы. Цитоплазматические мембраны отграничивают также ядро. Имеется митотический аппарат. Организм взрослого человека состоит из примерно 10" клеток, подразделяющихся на более чем 200 типов, существенно различающихся как строением, так и функциями. Однако при имеющихся несомненных различиях клетки всех этих типов имеют общие черты строения.

Эукариотическая клетка состоит из таких компонентов (рис. З.1.):

1.Клеточная оболочка (клеточная поверхность).

2.Цитоплазма.

3.Ядро.

В свою очередь, каждый из этих трех компонентов клетки состоит из нескольких частей.

Клеточная оболочка образована трех частями: снаружи располагается гликокаликс, затем идет цитоплазматическая мембрана (цитолемма, плазмолемма), а иод ней находится

подмембранный слой опорно-сократительных структур.

Цитоплазма также состоит из трех частей: гиалоплазмы, органелл и включений.

Ядро построено из четырех компонентов: 1) ядерной оболочки, или кариолеммы, 2) ядрышка, 3)

хроматина (хромосом), 4) ядерного сока (кариолимфы).

https://t.me/medicina_free

КЛЕТОЧНАЯ ОБОЛОЧКА

Основной частью клеточной оболочки является цитоплазматическая мембрана (цитолемма), которая имеет строение элементарной биологической мембраны, являясь самой толстой из всех других клеточных мембран (7,5-11 нм).

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ — это липопротеидные образования, которые ограничивают клетку снаружи и формируют некоторые органеллы, а также оболочку ядра. В электронном микроскопе имеют трехслойную структуру (два темных слоя разделены светлым слоем) из-за особого расположения структурных компонентов (рис. 3.2). Основными химическими компонентами клеточных мембран являются липиды (40%), белки (50%) и углеводы (10%).

Молекулы липидов мембран состоят из двух частей: гидрофильной и гидрофобной, т.е. полярны. С полярностью липидов мембран связана их проницаемость для веществ. Неполярные соединения легко проникают через нее, тогда как полярные (например, белки) могут проникать в клетку только путем эндоцитоза (см. ниже). В мембранах липиды образуют ли-пидный бислой, в котором молекулы липидов имеют характерное расположение: гидрофобные концы (хвостики) спрятаны внутрь бислоя, а гидрофильные части находятся снаружи. Хвостики липидов образуют центральный светлый слой мембран. Среди липидов (липоидов) мембран выделяют фосфолипиды, сфинголипиды, а также холестерин. Из мембранных фосфолипидов может высвобождаться арахидоновая кислота, являющаяся предшественником ряда биологически активных веществ и гормоноидов: простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов и других,

выполняющих множество функций (медиаторы воспаления, вазоактивные факторы, вторичные посредники и др.).

Белки мембран разделяются на 3 основных группы: поверхностные белки расположены или снаружи, или изнутри липидного бислоя; они непрочно связаны с поверхностью мембраны и чаще находятся вне липидного бислоя; интегральные (трансмембранные) белки проходят через всю толщину бислоя; полуинтегральные белки проникают только до половины липидного бислоя. По функции белки мембран могут быть белками-ферментами, белками-реценторами, транспортными, а также структурными белками.

Белковые молекулы располагаются в липидном бислое мозаично и могут "плавать" в "липидном море" наподобие айсбергов. При межклеточных взаимодействиях может происходить концентрация их на взаимодействующих участках нитолеммы в виде агрегатов (так называемый кэппинг). В перемещении белков важную роль играют элементы цитоскелета (микро-

филаменты).

Описанная модель строения биологических мембран называется жидкомозаичной квазикристаллической (мембрана имеет кристаллоподобную структуру, в которой, однако, белки не закреплены, а подвижны благодаря текучести мембраны).

Углеводы мембран входят в их состав не самостоятельно, а являются частями сложных белков и липидов-гликопротеидов и гликолипидов.

ФУНКЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН

1. Разграничительная — отделяют клетку от внеклеточной среды, ядро от цитоплазмы, содержимое органелл от их микросреды и т.д.

https://t.me/medicina_free