2 курс / Гистология / Востриков_В_М_Олигодендроглия_в_мозге_человека_при_шизофрении

41

3.2 Методы исследования

Подсчет численной плотности олигодендроцитов

Срезы, • окрашенные крезиловым фиолетовым по Нисслю,

изучали в световом микроскопе Reichert Polyvar (Австрия) с

иммерсионным объективом 100 х (N.A. = 1.40). Поля 9 и 10

префронтальной коры и их слои идентифицировали по цитоархитектоническим критериям, описанным С.А. Саркисовым и соавт. (1949). Олигодендроциты идентифицировали по их маленькому округлому или овальному ядру (5-7 мкм в диаметре) с компактным хроматином и по узкому ободку светлой цитоплазмы. Изображение из микроскопа при помощи видеокамеры передавалось на видеомонитор персонального компьютера. Обработку полученного изображения проводили на экране видеомонитора при помощи программы Image Expert, v. 1.00, (FEI Company). Для точного измерения перемещения объектива микроскопа относительно оси Z на его корпусе был неподвижно укреплен механический микрокатор ИГП (Россия), который измерительным наконечником касался предметного столика микроскопа. Цена деления шкалы микрокатора 0,5 мкм, допустимая погрешностью измерений 0,25 мкм.

Численную плотность олигодендроглиоцитов (Nv) определяли при помощи метода оптического диссектора (Gundersen H.J.G. et al., 1998). Данный метод основан на получении серии тонких параллельных «оптических срезов» внутри толстого окрашенного парафинового среза путем перемещения плоскости фокуса изображения вдоль оси Z с одинаковым шагом, используя микровинт микроскопа (рис. 2).

Толщину оптического среза, которая равна расстоянию между шагами, измеряли при помощи шкалы микрокатора. Изображение оптического среза выводилось на экран монитора, и на это изображение накладывалась объективная тестовая рамка с двумя

44

проводили подсчет олигодендроцитов внутри оптического

диссектора, после чего тестовую рамку перемещали с равным

интервалом (3 рамки) вдоль слоя VI (или подлежащего белого вещества). Число клеток подсчитывали в 10 оптических диссекторах

на одном срезе, таким образом, подсчет был проведен в 100 диссекторах для слоя VI и 100 диссекторах для подлежащего

вещества для каждого случая. Для коллекции лаборатории

клинической нейроморфологии НЦПЗ РАМН число подсчитанных

120 000. Численную плотность олигодендроглиоцитов выражали как число клеток в 0,001 мм .

Измерение площади срезов нейронов и подсчет числа

перинейрональных олигодендроцитов

Срезы исследовали в световом микроскопе Reichert Polyvar (Австрия) с иммерсионным объективом 100 х (N.A. = 1.40), из которого изображение при помощи видеокамеры передавалось на видеомонитор персонального компьютера. Обработка изображения осуществлялась на экране видеомонитора при помощи программы Image Expert, v. 1.00, (FEI Company). Пирамидные нейроны были идентифицированы по их треугольной форме, светлому овальному ядру с ясно видимым ядрышком, по наличию интенсивно окрашенной цитоплазмы и вертикального апикального дендрита. Для измерения площади срезов нейронов и числа перинейрональных олигодендроцитов систематическим случайным способом отбирали 10 пирамидных нейронов с ясно видимым ядрышком в каждом из трех подслоев слоя III, и их изображение вносили в память

46

Подсчет численной плотности перикапиллярных

олигодендроцитов

Измерение численной плотности перикапиллярных олигодендроцитов проводили при помощи светового микроскопа Reichert Polyvar (Австрия) с объективом 25/0,45, от которого изображение через видеокамеру передавалось на видеомонитор персонального компьютера. Обработку полученного изображения проводили на экране видеомонитора с использованием программы Image Expert 1.00, (FEI Company). В каждом срезе в слое V отбирали 10 прямолинейных сегментов капилляров путем систематического случайного отбора. Таким способом из каждого диагностического случая было отобрано 100 прямолинейных сегментов капилляров, итого 3 200 сегментов на группу. Общее число отобранных сегментов капилляров составило 6400. Длина каждого сегмента измерялась, число олигодендроцитов расположенных вдоль сегмента подсчитывалось, и численная плотность перикапиллярных олигодендроцитов выражалась как число клеток на 0,01 мм длины капилляра.

Электронно-микроскопическое исследование

Для электронно-микроскопического исследования отбирался аутопсийный материал, где интервал между смертью больного и началом фиксации составлял не более 6 часов, в течение которых согласно литературным данным, ультраструктура мозговой ткани остается достаточно сохранной (Агафонов В.А., Савулев Ю.И., 1977). Маленькие кусочки ткани поля 10 размером 1x3x2мм, взятые перпендикулярно поверхности коры, фиксировали путем иммерсии в смеси 2,5% раствора глютаральдегида и 4% раствора параформальдегида на 0,1 М фосфатном буфере в течение 1 недели. Из этих кусочков перпендикулярно поверхности коры вырезали более мелкие кусочки, содержащие все корковые слои, отмывали в

47

фосфатном буфере и дополнительно фиксировали в 1% тетрооксиде осмия в течение 1 часа. Затем кусочки обезвоживали в восходящей серии этилового спирта и заливали в эпоксидную смолу аралдит. Полутонкие (1 мкм) и ультратонкие срезы были получены на ультрамикротоме Ultracut-E (Reichert, Австрия). Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим и просматривали в световом микроскопе для ориентации в слоях коры. Ультратонкие срезы докрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе ЕМ 420 (Philips, Голландия).

3.3 Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6,0 (StatSoftJnc, Tusla OK, USA). Поскольку значения показателей (численная плотность олигодендроцитов, площадь нейронов, число перинейрональных олигодендроцитов и число перикапиллярных олигодендроцитов) в каждой из групп имели нормальное распределение и равные дисперсии, применяли параметрические методы. Были использованы следующие виды статистического анализа: 1) для оценки величины различий исследуемых параметров (численной плотности перикапиллярных олигодендроцитов, площади нейронов, числа перинейрональных олигодендроцитов и числа перикапиллярных олигодендроцитов) между группами вычисляли доверительный интервал — ДИ (при уровне значимости 0,05) для средних показателей в группах и для разности этих средних между группами; 2) для определения влияния факторов диагноза (уровни фактора: контроль, шизофрения, маниакально-депрессивный психоз, депрессия), пола (уровни фактора: мужской, женский), полушария (уровни фактора: левое, правое) на исследуемые параметры проводили однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA); 3) для выявления возможного совместного влияния факторов диагноза, пола и полушария на

48

исследуемые параметры осуществляли многофакторный дисперсионный анализ (MANOVA); 4) дополнительно, для выявления влияния указанных факторов (см. п. 3), с учетом влияния непрерывных переменных (посмертного интервала и времени фиксации в формалине), применяли многофакторный дисперсионный ковариационный анализ (MANCOVA); 5) для выявления связи между исследуемыми параметрами, с одной стороны, и возрастом, длительностью заболевания, дозой нейролептиков, посмертного интервала, времени фиксации в формалине, с другой стороны, проводили корреляционный анализ Пирсона.

50

депрессивного психоза - 50,9+15,9, ДИ = 42,1; 59,7, в группе

депрессии - 58,5 ±18,8, ДИ=48,1; 68,9. Разница средних значений по сравнению с контролем в группе шизофрении была 18,1 с

уменьшением на 25%, ДИ = 4,9; 31,3, в группе маниакально-

депрессивного психоза - 21,1 с уменьшением на 29%>, ДИ=7,9; 34,3, в группе депрессии - 13,5 с уменьшением на 18,7%, ДИ=0,3; 26,7. Во всех трех попарно сравниваемых группах ДИ не включает ноль, из этого следует, что существуют различия между контрольной группой и психиатрическими группами при уровне статистической значимостир<0,05 (табл. 5).

При однофакторном дисперсионном анализе (ANOVA) было обнаружено статистически значимое влияние фактора диагноза на средние значения Nv олигодендроцитов в группах F(3,56) = 4,0, р = 0,012. При апостериорных сравнениях средних значений (Дункан тест) было выявлено уменьшение Nv олигодендроцитов в группе шизофрении на 18% (р = 0,01), в группе маниакально-депрессивного психоза на 21% (р = 0,004), в группе депрессии на 13,5% (р = 0,04) по сравнению с контрольной группой. Между психиатрическими группами статистически значимые различия не выявлены (табл. 5, рис. 6).