3. Классификация спермы производителей по густоте (млрд./мл)

Производитель	Густая	Средняя	Редкая
Бык Баран Хряк Жеребец	> 1,0 > 2,0 >0,20 >0,25	0,6-1,0 1,0-2,0 0,10-0,20 0,15-0,25	<0,6 <1,0 <0,10 <0,15

Определение густоты спермы дает лишь приблизительное представление о содержании в ней половых клеток. А для выбора степени разбавления необходимы точные данные об их концентрации. И если в лаборатории племпредприятия определяют концентрацию спермиев в каждом эякуляте, то при микроскопическом исследовании основное внимание уделяют изучению подвижности спермиев.

В эякуляте обычно имеются спермин различного возраста, различной степени зрелости и подвижности. Если разделить их на три группы: спермиев с прямолинейным поступательным движением, с колебательным и манежным движением и совсем неподвижных, очевидно, что оплодотворяющая способность спермы будет зависеть от соотношения между количеством спермиев первой и второй-третьей групп. Чем больше нормальных спермиев с прямолинейным движением, тем в большей мере можно ожидать высокой оплодотворяющей способности.

При визуальном микроскопическом исследовании оценивается подвижность не отдельных спермиев, а подвижность их в образце спермы в целом. Результаты оценки выражают в баллах. Высшую оценку 10 баллов получает сперма, в которой почти все спермин (100%) обладают поступательным прямолинейным движением, 9 баллов – если около 90% клеток имеет такое движение, и т. д. Для разбавления в искусственных средах используют сперму барана и быка с подвижностью не ниже 8 и 7 баллов, хряка – 7 баллов и жеребца – 6 баллов.

Глазомерная микроскопическая оценка довольно субъективна, но, по данным ВанДемарка и Солсбери, способность хорошо подготовленных лаборантов постоянно давать один и тот же балл повторным образцам спермы, предъявляемым в случайном порядке, очень высока, выше, чем этого можно было ожидать. Поэтому У квалифицированных специалистов эта оценка является надежной гарантией использования спермы только хорошего качества.

Для более объективной оценки подвижности спермиев, что особенно необходимо начинающим лаборантам, можно использовать метод, предложенный Бреди и Гилдоу. Метод основан на применении гемоцитомет-ра. На одну сетку гемоцитометра наносят сперму, разбавленную физиологическим раствором, на другую -разбавленную в той же степени дистиллированной водой или гипертоническим раствором натрия хлорида. Подсчитывают все клетки на второй сетке и только неподвижных спермиев – в равном количестве квадратов на первой сетке, где помещена сперма, разбавленная физиологическим раствором. По разнице результатов подсчета находят процент подвижных спермиев.

При визуальном определении подвижности спермиев необходимо строго поддерживать оптимальную для их движения температуру (около 40°С). Особенно это важно при оценке спермы быка и барана. Для свежеполученной спермы жеребца и хряка допустима в крайнем случае температура около 20°С. В госплемпред-лриятиях и пунктах по искусственному осеменению используют электрические обогревательные столики к микроскопам.

Определение концентрации спермиев. Концентрацию половых клеток в сперме можно определить несколькими методами: путем подсчета в счетной камере (гемоцитометре); при помощи фотоэлектрокалори-метра, спектрофотометра, а также специального электронного счетчика.

Для прямого подсчета спермиев в эритроцитарный (для барана и быка) или в лейкоцитарный (для жеребца и хряка) меланжер (смеситель) набирается исследуемая сперма и разбавляется дистиллированной водой или 3%-ным раствором натрия хлорида, которые убивают спермиев. Сперму барана разбавляют в 200 раз, быка – в 100 раз, жеребца и хряка – в 20 раз. Разбавленную сперму вносят в подготовленный гемоцитометр с сеткой Горяева (или другой какой-либо сеткой) и под микроскопом подсчитывают спермин в 80 малых квадратиках, затем пересчитывают на кубический сантиметр (мл). Точность подсчета этим методом составляет ±8% , причем более половины всех подсчетов имеют отклонения около 5%.

Прямой подсчет спермиев в счетной камере утомителен и требует много времени. Он используется в практике как дополнение к фотоэлектрокалориметрическому способу при построении и периодической проверке калибровочных кривых, а также при изготовлении стандартов для визуального определения концентрации спермиев.

Метод фотоэлектрокалориметрии (денситометрии) основан на том, что с увеличением числа спермиев в сперме мутность ее увеличивается, и поэтому светопоглощение (оптическая плотность) различных образцов спермы при стандартном ее разбавлении повышается прямо пропорционально концентрации половых клеток. Впервые способ фотометрии использовали Комсток и Грин при работе со спермой барана и Генле и Зиттл при изучении метаболизма спермиев быка. В практику внедрен этот способ Солсбери. На Украине Ф.Осташко и П.Гайворонский разработали методику определения концентрации спермиев в сперме с помощью прибора ФЭК-М. В настоящее время племпредприятия и центры по искусственному осеменению используют более совершенные фотоэлектрометрические приборы, универсальные или приспособленные для работы со спермой (рис. 39).

Для определения концентрации спермиев в сперме при помощи фотометрических приборов свежеполученную сперму разбавляют 3,5%-ным раствором натрия лимоннокислого в соотношениях 1:400 (барана), 1:100 (быка) и 1:30 (жеребца и хряка). Для этого берут сперму и раствор в соотношении 0,025 и 10 мл (для барана), 0,1 и 10 мл (для быка), 0,4 и 12 мл (для жеребца и хряка). Разбавленную сперму наливают в кювету с рабочей длиной 10 мм и определяют оптическую плотность при красном или темно-красном светофильтре. По заранее приготовленной калибровочной кривой устанавливают концентрацию спермиев в сперме. Точность метода не ниже, чем при прямом подсчете клеток.

Наиболее точно определить концентрацию сперматозоидов в сперме можно с помощью специальных электронных счетчиков. В этих приборах разбавленная сперма пропускается через капилляр так, что между электродами проходит только один сперматозоид. Головка его вызывает резкое увеличение сопротивления и это регистрируется счетчиком.

Такие счетчики необходимы и при оценке качества разбавленной спермы путем фильтрации через сэфа-декс гель или стекловату. Приготовленный сэфадекс гель укладывается поверх пробки из стекловаты на дно пластикового шприца, используемого в качестве фильтрационной колонки. Фильтр колонки промывается буфером и в нее вносится небольшое количество спермы. Затем система промывается большим количеством буфера и в фильтрате подсчитывается число сперматозоидов. Мертвые или поврежденные клетки, а также отдельные формы абнормальных клеток остаются в фильтрационной колонке, тогда как живые проходят через нее. Считают, что целостность мембраны и поверхности сперматозоидов определяет возможность продвижения их через такую систему. Отмечена высокая степень зависимости оплодотворяющей способности спермы от соотношения живых и мертвых сперматозоидов.

В сохраняемой сперме можно определить количество сперматозоидов (в единице объема или дозе) по содержанию ДНК. Для определения ее необходим буфер, специальный краситель и флуорометр. В каждом сперматозоиде содержится 3,3 пкг ДНК.

Дифференциальная окраска живых и мертвых спермиев. Этот метод является хорошим дополнением к оценке подвижности спермиев. Впервые предложен В. А. Морозовым в 1938 г. Метод основан на том, что живые спермин, обладающие поступательным движением, не воспринимают краску, мертвые и, возможно, клетки с колебательным движением хорошо окрашиваются той же краской. В качестве красителя автор использовал 5%-ный водный раствор эозина. Каплю этой краски наносят на край обезжиренного предметного стекла и добавляют каплю свежеполученной спермы; обе капли смешивают и делают тонкий мазок, который должен быстро высохнуть. После этого под микроскопом подсчитывают 500 спермиев и выводят процент неокрашенных (живых) клеток.

Блом рекомендовал использовать сочетание эозина с нигрозином. Нигрозин придает темный фон препарату, на котором контрастнее видны неокрашенные головки спермиев. По Блому одну каплю спермы смешивают с каплей 5%-ного водного раствора эозина и двумя каплями 10%-ного раствора нигрозина в дистиллированной воде и затем делают мазок.

Зарубежные организации используют следующий рецепт красителя: растворяют 1 г эозина синеватого (спирто- или водорастворимого, содержание краски 88%) и 4 г берлинской лазури (анилин голубой) в 100 мл 1/8 молярного фосфатного буфера. Для приготовления буфера растворяют 1,702 г КН₂РО₄ в 100 мл дистиллированной воды и 1,776 г безводного Na₂НРО₄ в 100 мл дистиллированной воды. Смешивают 28,5 мл раствора КН₂Р0₄ и 71,5 мл раствора Na₂HP0₄. Краситель растворяют в буфере (рН 7,2) и прогревают в водяной бане при 85°С в течение 10 мин. Финальная рН красителя должна быть 6,6. Хранить его можно в холодильнике при 5°С.

Для приготовления мазков берут 0,03 мл красителя и капельку спермы. Не позднее чем через 15 с после приготовления мазок помещают на 30 с на обогревательный столик (45-55°С) для высушивания. Просматривают до 100 клеток под иммерсионной системой микроскопа (1000х).

На результаты оценки спермы этим методом оказывают влияние рН смеси, концентрация применяемых красителей и время, за которое может произойти окрашивание клеток. Поэтому следует постоянно выдерживать условия приготовления мазков, а также одинаковый рецепт раствора красителя.

Определение процента патологических (морфологически ненормальных) спермиев. Для спермиев каждого вида животных характерна своя структура и величина. Появление же в эякуляте значительного числа клеток с явными отклонениями в их структуре сопровождается резким понижением плодовитости производителя. Поэтому на госплемпредприятиях необходимо периодически (один-два раза в год) тщательно просматривать образцы спермы и при выявлении увеличения числа ненормальных клеток внимательно обследовать производителя.

Впервые попытку найти зависимость оплодотворяющей способности спермы от морфологических особенностей спермиев предприняли в 1925-1927 гг. Уильяме, Сэвиджи Фаулер. Изучая длину головки спермиев, они установили, что у быков с хорошей оплодотворяющей способностью величина коэффициента вариации этого показателя не превышает 4%. Лагерлеф также получил для 30 нормально плодовитых быков коэффициент вариации длины головки спермиев в среднем 3,77, для 15 производителей с пониженной плодовитостью - 4,82 и для 30 бесплодных или почти бесплодных животных – 6,15. В последующем Уильяме и Сэвидж обратили внимание не только на отклонения в величине, но и в форме спермиев, и рекомендовали использовать исследование морфологии половых клеток как ценный метод в оценке потенциальной плодовитости быков.

Некоторые морфологические особенности спермиев можно обнаружить при обычном исследовании неокрашенных мазков. Но более надежно исследование производить в окрашенных сухих мазках под микроскопом с иммерсионной системой. Для измерения головок используют окулярный винтовой микрометр. Если же его нет, то посредством проекционной установки получают проекции изображения клеток на матовое стекло и измеряют их при помощи миллиметровой линейки; измеряют до 500 спермиев. Общепринятыми методами вычисляют среднюю арифметическую, квадратическое отклонение и величину коэффициента вариации.

Измерение спермиев хотя и не является сложным приемом, но требует значительных затрат времени, соответствующих приборов и приспособлений к микроскопу. Поэтому в практике работы племпредприятий чаще всего ограничиваются общим исследованием морфологических особенностей спермиев и вычислением процента их с патологической формой. Проводя исследования морфологии половых клеток, необходимо соблюдать ряд установленных правил, чтобы избежать появления артефактов. Прежде всего, при приготовлении мазка следует предотвратить холодовый удар, в результате которого хвостики спермиев закручиваются и невозможно отличить такие клетки от тех, которые образовались в семенниках. Попадание воды (например, влажное предметное стекло) также вызывает этот артефакт. Свежеполученные спермин легко разламываются в области шейки, что приводит к увеличению процента бесхвостых головок. Чтобы предотвратить такую опасность, можно до исследования сперму выдержать при комнатной температуре. Спермин после хранения менее чувствительны к разломам.

Перед приготовлением мазка сперму разбавляют изотоническим раствором натрия хлористого или натрия лимоннокислого. Если этого не сделать, то мазок получится густым и трудно будет просматривать отдельных спермиев. Густота спермы очень варьирует, но обычно бывает достаточно к 1 мл раствора, внесенного в пробирку, добавить одну каплю спермы быка. Степень разбавления спермы барана должна быть большей, спермы хряка и жеребца - меньшей. Температура раствора и спермы перед смешиванием должна быть одинаковой. Смешивание проводят осторожно, путем легкого постукивания пальцем по нижнему концу пробирки. Каплю приготовленной смеси помещают на обезжиренное предметное стекло. Другое, шлифованное стеклышко подводят под углом 30-35° к капле так, чтобы она растеклась сзади него, и быстро, но плавно тянут каплю вдоль предметного стекла. Если сперма хранилась несколько часов, то можно нанесенную на предметное стекло каплю спермы накрыть вторым таким же стеклом и плавно и ровно протянуть его по первому. Мазки высушивают при температуре 36-37°С, а затем фиксируют на пламени или погружением на 1-2 мин в стаканчик с 96%-ным этиловым спиртом. После фиксации .производят окрашивание. Используют самые различные красители, вплоть до чертежной туши. Хорошие результаты получают при двойном окрашивании анилиновым генцианвиолетом и карболовым фуксином Циля. Но наилучшим методом, по мнению ВанДемарка и Солсбери, является исследование неокрашенных мазков под фазовоконтрастным микроскопом.

Из всех исследуемых образцов спермы готовят 2-3 мазка, просматривают под микроскопом с иммерсионной системой и в каждом из них подсчитывают 100-200 спермиев. Это дает более надежные результаты, чем просмотр большего количества клеток (до 500) в одном мазке. При подсчете ненормальных спермиев придерживаются какой-либо классификации. Аномалии в структуре спермиев классифицируют по измененным частям: аномалии в области головки, шейки, средней части (тела) и хвоста. Головки могут быть двойными, конусообразными и грушевидными, круглыми, сморщенными, большими, узкими, удлиненными, уменьшенными, асимметричными. Наиболее частые аномалии шейки: сломанные шейки, бесхвостые головки. Аномалии тела: изогнутые, разорванные, удлиненные, утолщенные, двойные, нитевидные и рудиментарные, а также ненормальное (абоксильное) прикрепление тела к головке. Аномалии хвостика: извитые, двойные, сломанные, изогнутые, закрученные и срезанные (рис. 40). Многие патологические изменения в структуре спермиев появляются в результате нарушения сперматогенеза. Особенно это относится к отклонениям в величине и форме головки, а также к нарушениям структуры тела и хвостика. Большие головки бывают у спермиев с диплоидным набором хромосом; головка и хвостовая часть у них, как правило, деформированы. Некоторые нарушения по своему происхождению генетические. К ним относят следующие.

Даг-дефект; обнаружен Бломом у датских джерсейских быков. На хвостике у спермиев отмечается образование узких петель и складок с расщеплением и отсутствием волокон.

Перелом шейки; обнаружен Хэнкоком и Роллинсоном у 12 молодых гернсейских быков, совершенно бесплодных. В сперме этих животных у 95% спермиев головки были отделены от шеек; лишенные головки половые клетки в большинстве случаев сохраняли на короткое время свою подвижность. В месте прикрепления шейки головка выщерблена.

Дефект акросомы – компактное утолщение ее; чаще встречается у быков фризской породы. У 50-85% спермиев на чехлике имеются маленькие, похожие на пузырьки темные пятна. Подвижность клеток снижена, оплодотворяющая способность утрачена. Эта аномалия наследуется как аутосомный простой рецессивный признак.

Эксцентрическое прикрепление хвостика и его штопорообразное закручивание; эта аномалия обнаружена у быков.

В сперме каждого производителя, даже с высокой плодовитостью, обнаруживаются морфологически ненормальные половые клетки, однако процент их обычно невысок. У животных с гипоплазией семенников, с воспалительными процессами Б них, а также при нарушениях условий кормления число таких клеток может резко возрастать.

В сперме барана содержание морфологически ненормальных спермиев не должно превышать 14%, в сперме быка – 18% , хряка и жеребца – 20% .

Определение метаболической активности спермиев. Предложены следующие методы: измерение поглощения кислорода из расчета на стандартное число клеток, определение скорости обесцвечивания метиленовой сини, определение индекса фруктолиза и величины рН. Каждый из этих способов достаточно объективно отражает активность метаболических процессов, происходящих в спермиях при температуре выше 20°С. Поэтому полученные результаты в большинстве случаев коррелируют с основным показателем качества

с пермы – ее оплодотворяющей способностью. Так, при определении количества поглощаемого кислорода Уолтон и Эдварде показали, что при высоком уровне дыхания (285 мкл в час из расчета на 1 млрд. спермиев) для получения оплодотворения требовалось от 1 до 1,9 осеменения в среднем на корову, при среднем уровне (187 мкл) - от 2 до 2,9 осеменения и при низком уровне (127 мкл) – от 3 до 3,9 осеменения. Установлена обратная связь первоначальной активности и концентрации спермиев с величиной рН и положительная связь индекса фруктолиза и скорости обесцвечивания мети-леновой сини с оплодотворяющей способностью и другими показателями качества спермы. В практике интенсивность метаболических процессов в спермиях чаще всего определяют по обесцвечиванию метиленовой сини и иногда – по использованию фруктозы.

В сперме хорошего качества быка и барана при нормальной буферности использование фруктозы продолжается в течение нескольких часов с постоянной скоростью. В сперме без буфера образовавшаяся в результате гликолиза молочная кислота понижает рН и прекращает гликолиз.

В процессе гликолиза при окислении фосфоглице-ринового альдегида выделяется водород, который переносится на пировиноградную кислоту, превращая ее в молочную. Метиленовая синь является хорошим акцептором водорода. При присоединении двух ионов водорода этот краситель теряет свой темно-синий цвет и превращается в лейкометиленовый синий, представляющий собой белый порошок. Водород фруктоза отдает в процессе метаболизма под воздействием внутриклеточного фермента дегидрогеназы. Реакция должна происходить без доступа воздуха, так как кислород воздуха быстро окисляет лейкометиленовый синий в мети л еновый.

Первым применил метиленовый синий при изучении метаболической активности спермиев Накано. Затем Н.П.Шергин и другие авторы разработали методы оценки качества спермы по скорости обесцвечивания этого красителя.

По Н.П.Шергину, на предметное стекло при помощи глазной пипетки наносят каплю свежеполученной спермы быка или барана и добавляют каплю 0,01%-ного раствора метиленовой сини, приготовленной на изотоническом растворе натрия хлористого; быстро перемешивают обе капли стеклянной трубкой с внутренним диаметром 0,8-1 мм и набирают в нее смесь так, чтобы образовался столбик длиной около 2 см без пузырьков воздуха (пены). Трубку кладут на белую бумагу при температуре 20°С и наблюдают, через какое время голубой столбик обесцветится. По концам, где мениски смеси соприкасаются с воздухом, окраска обычно не изменяется. Оценивают сперму исходя из сроков обесцвечивания: хорошая – для быка 5-10 мин, для барана – 3-7 мин; средняя – для быка 11-30 мин, для барана 8-12 мин; плохая – более 30 мин для быка и более 12 мин для барана.

Метод Бека и Солсбери позволяет сократить сроки проведения исследования. Сущность метода заключается в следующем. В бактериологическую пробирку вносят 0,2 мл спермы, разбавленной 0,8 мл желточного нитрата, и добавляют 0,1 мл раствора метиленовой сини, приготовленной из 50 мг красителя и 100 мл изотонического раствора натрия цитрата; содержимое смешивают и покрывают слоем минерального (вазелинового) масла толщиной 1,25 см. Пробирку помещают в водяную баню с регулируемой температурой при 46,0°С. При такой температуре восстановление метиленовой сини происходит наиболее быстро, а бактерии, попавшие в образец при получении или обработке спермы, не оказывают влияния на результаты, так как многие из них погибают. Лучшие по качеству эякуляты обесцвечивают краситель в течение 3 мин и меньше.

Определение выживаемости (живучести) спермиев вне организма. При искусственном осеменении сперма используется не сразу после ее получения, а только после какого-либо срока хранения. В этот период оплодотворяющая способность различных образцов спермы сохраняется неодинаково. Имеется определенная зависимость основного показателя качества спермы от устойчивости ими сохранять подвижность при стандартных условиях (например, при температуре, близкой к 0°С). В.К.Миловановым был предложен метод, который позволяет одновременно проследить за характером снижения активности спермиев в течение всего срока исследования, определить максимальную продолжительность жизни отдельных спермиев и найти оптимальную степень разбавления. Но так как в настоящее время степень разбавления спермы варьирует в более узких пределах, чем было предусмотрено автором, то метод этот в полном объеме не используется. Чаще образец спермы после стандартного разбавления эякулята оставляют в холодильнике при 2—4°С и ежедневно определяют активность спермиев при температуре 38-40°С до полной их гибели. Суммировав все произведения времени (в часах), в течение которого наблюдалась та или иная активность, на активность спермиев (в баллах), получают абсолютный показатель живучести. Для спермы барана он должен быть не ниже 1600, для спермы быка – 1000-1400, для спермы жеребца – 400-730 и для спермы хряка – не ниже 700-800. Максимальная продолжительность жизни спермиев (в часах) должна быть: для быка – не менее 200, для барана – 250, для жеребца -не менее 300.

Для определения выживаемости спермиев в замороженных эякулятах применяют экспресс-метод. Из каждого дуплетного эякулята по 2 дозы спермы ставят на инкубацию в водяную баню при температуре 38°С. Фиксируют время оттаивания и одновременно определяют исходную подвижность спермиев. Через 5 ч оценку повторяют. Пригодной для осеменения считают сперму (быка), исходная подвижность которой не менее 4 баллов и выживаемость 5 ч.

Определение резистентности спермиев. Методы определения качества спермы, при которых имитируются неблагоприятные для спермиев условия, были предложены как средство для проверки устойчивости половых клеток к разбавлению и хранению при низких' температурах, когда накапливаются кислые метаболиты. Наиболее широко применялось титрование (разбавление) спермы растворами кислот или натрия хлористого. Сейчас эти методы утратили свое значение, так как почти не дополняют результаты, получаемые при применении обязательных методов оценки качества спермы.

Значение оценки качества спермы. Окончательной оценкой качества спермы является уровень оплодотворяемости самок. Но для решения вопроса об использовании спермы сразу же после ее получения этот показатель неприемлем. Необходимы такие тесты, на основании которых можно было бы достаточно объективно и правильно прогнозировать оплодотворяющую способность спермы.

Определение объема эякулята, концентрации спермиев в сперме и процента подвижных спермиев должно проводиться постоянно. Получаемые с помощью этой оценки данные необходимы для установления уровня разбавления спермы и для оценки спермопродукции производителей. В дополнение к этим показателям на каждом госплемпредприятии, исходя из конкретных условий, необходимо выбрать и несколько других методов, которые позволят дать более полную характеристику эякулятам. Выбор метода может определяться условиями предварительного отбора молодых производителей, особенностями кормления, содержания и режима их использования, способами обработки и хранения спермы.

Периодическое определение процента морфологически ненормальных спермиев будет полезным в тех случаях, когда при отборе молодых производителей мало уделяется внимания состоянию их здоровья. В то же время отобранные на основании тщательных ветеринарных исследований животные, для которых в дальнейшем созданы оптимальные условия кормления и содержания, в течение всего периода использования могут образовывать минимальное количество морфологически ненормальных спермиев. Определение числа их уже не будет иметь такого значения.

При оценке роли любого показателя качества спермы придают большое значение наличию или отсутствию связи его с оплодотворяющей способностью. Однако следует иметь в виду, что такая связь нестабильна и может изменяться, причем нередко в сторону снижения. Это обусловлено тем, что по мере ужесточения требований к качеству спермы уровень оплодотворяемости самок повышается, приближаясь к. максимальному для данного вида животных. Дальнейшее же повышение того или иного показателя качества спермы не будет сопровождаться повышением оплодотворяемости.

Например, когда в недостаточной мере учитывали процент подвижных спермиев в эякуляте, связь этого показателя с оплодотворяемостью была высокой. Но когда стали выбраковывать эякуляты с подвижностью спермиев 5 баллов и менее, взаимосвязь первоначальной подвижности и оплодотворяемости ослабла. Но это было при условии включения в дозу для осеменения подвижных клеток в количестве, превышающем необходимый минимум.

В настоящее время сперму используют более рационально и строго дозируют число спермиев в ней с прямолинейным поступательным движением. Поэтому связь оплодотворяемости с процентом подвижных спермиев даже в пределах 6-10 баллов может быть существенной. Так, по данным Д.Вильтбанкаи Н.Париша, количество коров и телок, осемененных спермой с подвижностью 8 баллов (80%) и более, было на 5% больше, чем при осеменении спермой с подвижностью 7 баллов (70%). Все это послужило основанием для расширения минимальной границы подвижности спермиев до 6-8 баллов (в зависимости от вида животных).

На уровень связи показателей оценки качества спермы с оплодотворяющей способностью может оказывать влияние опыт работы специалистов племпредприятия. С приобретением опыта повышается качество отбора эякулятов без увеличения пороговых значений показателей оценки. Повышение отдельных показателей выше пороговых значений не приводит к повышению оплодотворяемоемости, а иногда даже сказывается отрицательно. Нестабильность взаимосвязи показателей оценки качества спермы и оплодотворяемости животных обусловлена и тем, что не всякие изменения в результатах оценки отражают изменение потенциальной оплодотворяющей способности. Особенно это касается изменения качества эякулятов от одного и того же производителя. Оно может быть вызвано изменениями режима использования, погодных условий, сезона года и т.д. Сильным изменениям подвержены объем эякулятов и процент подвижных спермиев; концентрация спермиев в сперме – более стабильный показатель.

Характер связи между отдельными показателями качества спермы специфичен для каждого вида животных. У быков первоначальная активность и концентрация спермиев в сперме обычно коррелируют положительно. Между рН эякулята и концентрацией спермиев, а также их активностью связь, как правило, отрицательная. С оплодотворяемостью наиболее устойчивая связь процента морфологически ненормальных спермиев, времени восстановления метиленовой сини, начальной подвижности и концентрации спермиев в сперме, выживаемости их при температуре 2-4°С, индекса фруктолиза. У хряков, по данным В. С. Антонюка, активность сукцинатдегидрогеназы (тест восстановления метиленовой сини) хорошо сопряжена с активностью и концентрацией спермиев

Научные исследования и результаты работы предприятий по искусственному осеменению говорят о том, что при использовании хотя бы четырех методов оценки качества спермы: определения процента подвижных спермиев, морфологически ненормальных спермиев, концентрации спермиев в сперме и какого-либо показателя их метаболической активности - есть возможность достаточно точно и объективно отобрать пригодные для осеменения эякуляты и обеспечить высокий уровень оплодотворяемости самок.

ПРИНЦИПЫ И МЕТОДЫ СОХРАНЕНИЯ СПЕРМЫ

При искусственном осеменении с момента получения спермы от производителя до внесения ее в половые пути самки проходит какой-то период времени. В течение этого периода оплодотворяющая способность спермы не должна снижаться. Чем дольше можно сохранить оплодотворяющую способность спермы, тем больше возможностей для проведения искусственного осеменения, тем шире оно будет использоваться. Сперму можно сохранить двумя способами.

Первый заключается в том, чтобы обеспечивать спермиев всеми необходимыми энергетическими веществами, ферментами, основными ионами и при этом удалять непрерывно из окружающей среды продукты распада, которые ограничивают выживаемость спермиев. Этот способ требует полных знаний о метаболических процессах, которые протекают в спермиях. Диапазон возможностей обеспечить физиологический уровень метаболизма в спермиях во внешней среде в течение продолжительного времени ограничен. Но даже, если бы была решена и эта проблема, такой способ сохранения спермы не может получить широкого распространения, так как не позволяет неограниченно долго поддерживать жизнедеятельность половых клеток из-за их биологических особенностей, поэтому может служить лишь базой для методов кратковременного сохранения оплодотворяющей способности спермы.

Второй, основной и практически единственно приемлемый способ, основан на торможении всех метаболических процессов, протекающих в половых клетках, до минимума. Торможение достигается физическим (высушиванием и изменением температуры) и химическим воздействием.

Сохранение спермы высушиванием сводится к уменьшению содержания воды в предварительно замороженных спермиях в вакууме до такого минимума, при котором жизненные биохимические реакции приостанавливаются или интенсивность их снижается до критической черты, и при добавлении воды реакции возобновляются. Предполагается, что высушенные спермин могут долгое время сохранять оплодотворяющую способность. В ряде экспериментов получено потомство от крольчих и коров после осеменения их высушенной спермой (Н.П.Ющенко, 1957; X.Мэримен и Е.Кефиг, 1959; Е.Ларсон и Е.Грехем, 1976). Однако до настоящего времени процесс высушивания полностью не разработан, а сама идея высушивания спермы пока является только лабораторной. Но осуществление ее дало бы большой экономический эффект, так как отпала бы потребность в сосудах Дьюара, азоте и постоянной его транспортировке.

Сохранение спермы при температуре около 0°С. Сразу же после эякуляции спермин проявляют высокую метаболическую активность и подвижность. При повышении температуры до 41-43°С подвижность их возрастает, а скорость гликолиза в сперме быка достигает максимума при 46,5°С. При температуре около 50°С происходят необратимые изменения (денатурация белка и др.), которые приводят к гибели клеток. Продолжительность жизни спермиев при температуре выше 20°С ограничена несколькими часами. Это связано с быстрым расходованием ими ряда химических соединений и неспособностью восстанавливать или поглощать их из внешней среды.

При понижении температуры интенсивность движения спермиев уменьшается, а при температуре 7°С они становятся неподвижными. При этом интенсивность метаболических процессов снижается, но полностью они не прекращаются и протекают еще на достаточно высоком уровне. Продолжительность сохранения оплодотворяющей способности спермиев при таких температурах (от 0 до -5°С.) увеличивается до нескольких дней. Этому способствует не только понижение метаболизма, но и лучшее обеспечение кислородом вследствие более высокой растворимости газов при низких температурах, а также повышение вязкости среды и торможение подвижности спермиев.

Прекращение подвижности и снижение интенсивности биохимических процессов в клетках (в т.ч. и в спермиях), тканях или же в целом организме называют анабиозом. Анабиоз (греч. anabios – оживление) –приостановка жизнедеятельности организма (клетки) при неблагоприятных условиях существования (например, при низких температурах) с возможным последующим восстановлением жизнедеятельности при наступлении благоприятных условий. Анабиоз - приспособительная реакция, переход в состояние покоя.

Понижение температуры может вызвать у спермиев и необратимые изменения. И. И. Иванов отмечал, что мужские гаметы по-разному реагируют на понижение температуры. В одних случаях уменьшение температуры от 40 до 0°С вызывало гибель спермиев, в других - понижение подвижности, но иногда подвижность их совершенно не изменялась. Н. А. Кузнецова и М. П. Викина (1931), проводя опыты по искусственному осеменению овец, заметили, что если получать сперму в холодную погоду или разбавлять ее холодным разбавителем, то спермин погибают. Позднее Н. А. Кузнецова показала, что гибель их происходит в результате резкого охлаждения. Ею и В.К.Миловановым было изучено это явление и названо "холодовым ударом" (температурным шоком).

Температурный шок возможен не только .при температурах выше (ГС, но и при отрицательных температурах до тех пор, пока сохраняется жидкая фракция и имеются условия для протекания осмотических процессов. Наиболее чувствительны к быстрому снижению температуры спермин хряка. В неразбавленной сперме быка температурный шок у спермиев возможен при температуре ниже 24°С. В разбавленной желточно-цитратным или молочным разбавителем сперме действие температурного шока может проявиться при резком снижении температуры ниже 16°С. В связи с этим в практике необходимо обращать внимание на скорость охлаждения разбавленной спермы, доводя ее (скорость) до оптимальной. В опыте В.Е.Эриксона сперму, разбавленную молочным разбавителем при температуре 32,2°С, охлаждали путем помещения флаконов в комнате с температурой 3,3°С или же предварительно погружали флаконы в водяную баню, которую также помещали в этой комнате. В первом случае сперма охлаждалась быстрее и достигала температуры 3,3°С через 110 мин, во втором случае – только за 240 мин. Оплодотворяющая способность медленно охлажденной спермы оказалась значительно выше, чем более быстро охлажденной (80,6% и 74,5%), хотя в обоих случаях скорость охлаждения была медленнее, чем применяется обычно.

Сперму быка, разбавленную желточно-цитратным разбавителем, охлаждают со скоростью около 0,5°С в минуту в случае хранения ее при 4-5°С и несколько медленнее – при хранении около 0°С. Сперму, разбавленную молочным разбавителем, необходимо охлаждать со скоростью 0,3-0,4°С в минуту. Разбавленную разбавителем сперму хряков охлаждают значительно медленнее – от 28-30°С до 6-10°С в течение 7-8 ч, т.е. со скоростью 2-5°С в час. При выдержке спермы хряков при комнатной температуре до момента разбавления снижается процент повреждений акросом спермиев в результате температурного шока.

После разбавления и расфасовки флаконы со свежеразбавленной спермой перед помещением в термосы со льдом должны быть обернуты теплоизоляционным материалом (ватой, поролоном и др.). При зарядке термосов зимой необходимо обращать внимание на температуру льда или снега (она может быть ниже 0°С). Некоторые авторы (Б.Люйет, П.Гехенис, Л.Гейльбрун, В.И.Белькевич и др.) считают, что причиной холодового удара является изменение физического состояния цитоплазмы (желатинизация) или коагуляция ее белков в результате выхода ионов кальция в цитоплазму. Активный перенос ионов натрия из клетки, а ионов кальция из окружающей среды в клетку обеспечивает натрий-калиевый насос, находящийся в клетке. Энергия для этого процесса поступает из АТФ. Температурный шок нарушает нормальный ход обменных процессов в клетках, энергия перестает вырабатываться, И работа такого "насоса" прекращается. Начинается пассивная диффузия ионов через мембрану с целью уравновешивания частиц в клетках и среде. Это приводит к утрате спермиями подвижности и метаболической активности. Потеря подвижности сопровождается выходом из спермиев в плазму внутриклеточных ферментов, протеинов. Происходит набухание и отслоение акросомы, перелом в области шейки спермия и скручивание хвоста. Степень повреждения акросом в спермиях быка достигает 25-30%, баранов – 50%, хряков – 75%. Спермин птиц наиболее устойчивы к быстрому охлаждению.

В возникновении температурного шока Ф.И.Осташко большое значение придает изменениям осмотического давления. Если поместить спермиев в гипотонический раствор или дистиллированную воду, то, вследствие повышения внутреннего давления, они быстро погибают. Под влиянием гипотонического раствора хвостики спермиев набухают и закручиваются. В гипертоническом растворе спермин погибают от обезвоживания. Они сморщиваются, хвостики их приобретают зигзагообразную форму. Особенно губительно для спермиев быстрое изменение осмотического давления. При понижении температуры охлаждение цитоплазмы спермиев происходит значительно медленнее, чем окружающей среды. Это приводит к возникновению различия в осмотическом давлении на границе оболочка клетки – окружающая среда. Например, при изменении в сперме быка температуры на 22°С падение осмотического давления составляет 0,6 атм. Этот перепад в осмотическом давлении вызывает ясную картину температурного шока. При постепенном снижении температуры осмотические явления протекают медленно и небольшое различие в давлении не вызывает гибели половых клеток. При очень быстром охлаждении спермы последствия осмотических влияний не успевают проявиться.

Температурный шок вызывает не только сдвиги баланса электролитов и осмотического давления, но глубоко затрагивает метаболизм клетки в целом, особенно обмен липидов, которые входят в состав мембраны клеток. Фосфолипиды спермиев представлены тугоплавкими альдегидами жирных кислот. При понижении температуры они затвердевают. Это, по мнению В.К.Миловановаи И. Н. Соколовской, блокирует дыхание и в значительной мере - гликолиз, так как нарушается обмен фосфатидов, нужных для образования АТФ, а АТФ необходим для гликолиза. Отмечаются явления температурного шока. Если выдержать сперму быка или барана в течение нескольких часов при комнатной температуре, то она становится нечувствительной к холодовому удару, так как за этот период успевает разложиться достаточное количество плазмогена и накапливаются нужные метаболиты (АТФ). Вводимый извне лецитин (из желтка куриных яиц), будучи при комнатной температуре веществом не твердым, а полужидким, благодаря наличию легкоплавких жирных кислот, адсорбируется спермиями и, вклиниваясь между молекулами плазмогена, понижает температуру его плавления. Не затвердевая при понижении температуры, лецитин продолжает снабжать спермиев нужными для дыхания и гликолиза веществами и, возможно, придает меньшую "хрупкость" богатому фосфолипидами внешнему слою хвостика. На поверхности клетки создается гидрофобная фаза, которая затрудняет обмен между цитоплазмой и окружающей средой. Таким образом предупреждаются явления температурного шока. Хранение спермы при температурах ниже 0°С. Попытки воздействовать на спермиев низкими температурами были предприняты Л.Спалланцани. Он отмечал восстановление подвижности спермиев теплокровных, подвергшихся замораживанию до -15°С. Позднее Мантегацца (1866) наблюдал восстановление подвижности клеток после оттаивания замороженной до -17°С спермы человека. И. И. Иванов добивался восстановления подвижности спермиев жеребца, подвергшихся воздействию холода (-15°С). И наконец, В.К.Милованов, И.И.Соколовская и И.В.Смирнов доказали возможность сохранения спермы в глубокозамороженном состоянии. И. В. Смирнов разработал оригинальную методику замораживания спермы. Капельку ее помещали в миниатюрный пакетик из фольги толщиной 15-20 мкм и погружали в кислород (-183°С) или спирт, охлажденный сухим льдом до -78,9°С. Сперма мгновенно замерзала. При подогревании восстанавливали подвижность 10-30% спермиев. В 1948 г. спермой, сохраненной в течение 32 суток, была осеменена 61 крольчиха и впервые в мире получено многочисленное потомство. В следующем году было осеменено 19 овцематок спермой, сохраненной при -183°С; от 7 окотившихся овцематок получено 11 ягнят. В 1950 и 1951 гг. Я Стюартом и И.В.Смирновым были получены телята в результате осеменения коров спермой, сохраняемой при -79°С. Причем Д. Стюарт использовал сперму, разбавленную желточно-цитратным буфером. Буфер содержал 0,86% натрия лимоннокислого, 40% желтка яиц и 16% очищенного глицерина.

В 1950-1952 гг. английские ученые Полдж и Раусон разработали пригодный для практического использования метод медленного замораживания спермы быка с использованием глицерина. Сперму разбавляли 1:1 желточно-цитратным разбавителем при температуре 28°С, охлаждали до 4-5°С в течение 4 ч, затем вторично разбавляли 1:1 тем же разбавителем, но с добавлением 20% глицерина и выдерживали при такой температуре около суток. После этого сперму расфасовывали в ампулы и медленно охлаждали их в сухом льду со спиртом со скоростью 1°С. в минуту до -15°С и ЗС в минуту до -79°С. Хранили сперму в жидком азоте при -196°С. Оплодотворяемость коров при осеменении сохраненной в течение 40 недель и более спермой составила 75%.

В последующие годы метод глубокого замораживания спермы и длительного хранения ее в жидком азоте совершенствовался и получил широкое распространение во всем мире. В скотоводстве он стал основным методом хранения спермы производителей. В практике применяется несколько технологий расфасовки, замораживания, хранения и использования спермы быков-производителей.

Замораживание представляет собой сложный процесс, при котором в подвергаемом холоду объекте легко могут возникнуть необратимые изменения. Степень этих изменений зависит от того, какое из трех возможных состояний оказывается преобладающим в этом объекте: переохлаждение, кристаллическое или стекловидное состояние.

Зона переохлаждения характеризуется жидким состоянием цитоплазмы. Находится несколько ниже 0°С и ниже точки замерзания, но не имеет определенной границы нижнего предела, так как зависит от многих факторов. Состоянию переохлаждения способствует равномерное понижение температуры, охлаждение в капиллярах или уменьшение объема охлаждаемой жид. кости, несоприкасаемость с воздухом, отсутствие толчков и встряхиваний жидкости. Эти факторы затрудняют появление центров кристаллизации, которыми для воды являются мельчайшие кристаллики льда. Применяя капилляры, можно добиться переохлаждения воды до -70°С или ниже.

При переохлаждении физиологические процессы замедляются, но не прекращаются. Однако изменяется скорость взаимосвязанных химических реакций, нарушаются функции выделения, осмоса и проницаемости, изменяется вязкость цитоплазмы, происходят процессы коагуляции. Это в конечном итоге может привести к гибели спермиев, которая обычно наступает раньше, чем израсходуются их энергетические ресурсы. При замораживании спермы состояние переохлаждения так же, как и понижение температуры среды ниже точки ее замерзания до критической температуры, поддерживается непродолжительное время и играет существенную роль в сохранении жизнеспособности клеток.

Переохлаждение – неустойчивое состояние и при малейшем нарушении условий охлаждения происходит переход этого состояния в более устойчивое – кристаллическое.

Зона кристаллического замерзания простирается от точки замерзания до -40°С. Эта зона также подвижна и зависит от многих факторов, в особенности – от состава замораживаемой среды. При понижении температуры уменьшается энергия теплового движения молекул и увеличивается вязкость среды. Это способствует появлению центров кристаллизации, после чего вещество быстро переходит в кристаллическое состояние. Оно (это состояние) необратимо - образовавшиеся вначале кристаллы сохраняются и при последующем понижении температуры.

Замерзание клеток и тканей протекает сложнее, чем обычных растворов. Это связано с тем, что в цитоплазме клеток растворены различные вещества, и клетка отделена от окружающей среды поверхностным слоем цитоплазмы, который препятствует проникновению внутрь зародышей кристаллов льда. При охлаждении сначала кристаллы льда образуются в межклеточных пространствах, что способствует обезвоживанию клетки повышению в ней концентрации растворенных веществ и нарушает строение цитоплазмы. Это, так же как и механическое повреждение кристаллами льда и давление льда, образовавшегося в межклеточном пространстве, является основной причиной гибели клеток. Образование льда может происходить и внутри клеток.

Замораживание спермы представляет собой процесс, близкий к высушиванию. При замораживании растворитель (вода) замерзает в виде кристаллов льда, а растворенные вещества не превращаются в кристаллы и скапливаются в оставшемся растворителе. Концентрация их постоянно возрастает. Образуется насыщенный (эвтектический) раствор с более низкой температурой замерзания. Он может вызвать растворение составных частей спермиев и их гибель.

Эти особенности замерзания определяют и характер понижения температуры в замораживаемой сперме. После переохлаждения начинается кристаллизация воды и выделение скрытой теплоты кристаллизации. Это приводит к повышению температуры (температурный скачок). В образовавшемся эвтектическом растворе температура непродолжительное время остается постоянной (на термограмме - плато), затем понижается, и кристаллизация продолжается. Опять выделяется теплота и отмечается второй температурный скачок. После каждого скачка - плато (рис. 41). При большой скорости охлаждения температурных скачков не наблюдается. Быстро охлажденная масса обладает запасом невыделенной теплоты отвердевания.

У стойчивость биологических объектов к замерзанию во многом зависит от количества воды, связанной с коллоидами цитоплазмы. Такая вода замерзает при более низких температурах и легче переводится в стекловидное состояние (витрификация).

Зона стекловидного состояния цитоплазмы находится в пределах границ кристаллического замерзания и абсолютного нуля; оно наи-

более благоприятно для сохранения жизни. Органические коллоиды цитоплазмы обретают стекловидное состояние, при котором структура живого вещества не изменяется, и поэтому клетки сохраняют жизнеспособность. Обретение стекловидного состояния возможно при быстром понижении температуры; способствует этому малый объем замораживаемой жидкости и большой перепад температур среды и замораживаемого объекта. Состояние витрификации менее устойчиво, что обусловлено большим запасом скрытой теплоты отвердевания замораживаемого объекта, которая сохраняется при переходе из жидкого состояния в твердое (стекловидное). При медленном оттаивании при температуре выше -100°С может происходить переход этого состояния в кристаллическое (девитрификация, рекристаллизация). Быстрым нагреванием можно миновать зону кристаллизации и перевести вещество из стекловидного в жидкое состояние. Устойчиво сохраняется стекловидное состояние при температуре ниже -130°С.

Замораживание спермы проводят после разбавления и предварительного охлаждения ее от 22-32°С до 4-5°С в течение 3-4 ч. Это необходимо для предупреждения температурного шока. Вредных последствий внутриклеточных изменений при последующем охлаждении избегают или в значительной мере ослабляют их путем внесения в разбавители глицерина, а также регулированием скорости замораживания.

В сперме быка кристаллы льда начинают образовываться при температуре -1,78°С, после чего точка замерзания повышается до -0,5°С. Добавление глицерина способствует понижению точки замерзания смеси. В сперме, разбавленной желточно-цитратной средой с 7% глицерина кристаллизация наступает при -10-12°С и ниже. Сначала кристаллы образуются в поверхностных слоях смеси, затем в более глубоких. Если перепад температур небольшой и замораживаемая масса достаточно велика, образуются большие кристаллы и образование их идет медленно. Такие кристаллы разрушают жизненно важные структуры спермиев и вызывают их гибель. При большом перепаде температур и малой массе спермы замораживание идет быстро с образованием мелких кристаллов. Когда же разница температур очень велика, образуется относительно однородная масса, т.е. происходит истинная витрификация. Вредные воздействия на клетки в данном случае сводятся к минимуму.

Изучение явлений, происходящих в процессе замораживания биологических объектов, позволило разработать рациональные способы расфасовки спермы, ее замораживания и использования. Предложенный в Англии способ расфасовки спермы в ампулы из силикатного стекла является наиболее надежным с технической и гигиенической стороны и первое время широко использовался во многих странах, особенно в США, Германии, Англии и Швеции. Однако для использования этого способа в масштабах крупных предприятий по искусственному осеменению нужны сложные и дорогостоящие ампулонаполнительные, ампулопечатные и ампулозапаечные машины, а для изготовления ампул пригодны только специальные сорта стекла, устойчивого к большим колебаниям температуры. Все это значительно затрудняло и удорожало применение этого способа. В настоящее время широко распространены Два основных'способа замораживания спермы быков: в полимерных соломинках (пайетах) и в форме открытых или облицованных гранул.

Способ расфасовки и хранения спермы в соломинках предложен в 1936 г. В. К. Миловановым и применен в Аскании-Нова. Желатинизированную сперму Разливали в натуральные соломины из междоузлий тростника с внутренним диаметром 5-6 мм или в искусственные из парафинированной бумаги; концы соломин закупоривали парафином. В Дании Э.Серенсеном (1938) натуральные соломины были заменены пластмассовыми, изготовленными из ацетилцеллюлозы, и внедрены в практику. Позднее во Франции Р.Кассу (1950) запатентовал способ укупорки пластмассовых соломинок с помощью набухающего от влаги порошка поливинилового спирта. .После внедрения этого изобретения синтетическая соломинка получила широкое распространение во многих странах мира. Соломинки оказались удобными не только при работе со спермой, сохраняемой при температуре около 0°С, но также и при работе с глубокозамороженной спермой. Благодаря правильной узкоцилиндрической форме соломинка обеспечивает равномерную по всей массе спермы быструю отдачу тепла при замораживании, а простая геометрическая форма предупреждает появление вредных напряжений в материале оболочки, которые могут привести к ее растрескиванию. Соломинка одновременно является приспособлением для расфасовки, хранения и транспортирования спермы и важной составной частью устройства для осеменения самки.

Диаметр и объем соломинок, предложенных Кассу, варьирует. В настоящее время чаше всего применяются соломинки объемом 0,25 и 0,5 мл. Для использования их при осеменении сконструирован специальный инструмент. Он представляет собой жесткую металлическую трубку с проволочным толкателем, который упирается в ватную пробочку с поливиниловым спиртом, которая после смачивания и затвердения служит поршнем.

В течение нескольких десятилетий работа с соломинками не прекращалась и в настоящее время интернациональной корпорацией IMV (Инструменты для Ветеринарной Медицины) созданы и производятся оборудование, приборы и инструмент для получения и оценки качества спермы, ее замораживания и хранения, а также инструмент для осеменения коров и телок (рис. 42). Это и другое оборудование, инструмент, материалы и среды для разбавления спермы являются неотъемлемой частью материальной базы одной из наиболее совершенных технологий искусственного осеменения и трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных, в создании которой большая роль принадлежит Р. Кассу.

В Литовском НИИЖ разработана байсогальская технология получения, замораживания, хранения и использования спермы быков (П.Пакенас и др., 1975). Укупорка соломинок решена здесь так: после заполнения спермой их с обеих сторон закрывают стеклянными шариками. В отличие от ватной пробки с поливиниловым спиртом стеклянные шарики полностью предупреждают потери спермы, которые неизбежны в технологии Р.Кассу. Литовское оборудование для маркировки и укупорки соломинок достаточно надежное и используется не только в Литве, но и в Беларуси и других странах СНГ (рис. 43).

Другой способ расфасовки спермы - в гранулы -также широко используется во многих странах. Этот способ был предложен П. П. Печниковым в 1959 г. Капли спермы наносили на металлическую пластину, охлажденную в жидком азоте. После затвердевания их помещали в жидкий азот и хранили в нем до момента использования. Таким образом были получены наилучшие результаты при замораживании спермы жеребца. Но только после сообщения японских ученых Нагазе и Нива на V Международном конгрессе по воспроизводству животных и искусственному осеменению в Тренто в 1964 г. этот способ получил широкую известность и распространился по всему миру.

А вторы использовали два хладагента: твердую двуокись углерода и жидкий азот. Капли спермы наносили в лунки блока твердой двуокиси углерода (сухого льда). В течение нескольких секунд они замерзали в виде шариков или эллипсоидов (гранул). Гранулы переносили в жидкий азот для хранения. Исключительная простота, сравнительно несложное и недорогое оборудование и высокие результаты осеменения коров гранулированной спермой явились причиной быстрого признания и широкого распространения этого способа. Однако он имеет и ряд существенных недостатков. Главный из них – это отсутствие у гранул какой-либо оболочки, следовательно, незащищенность их от усыхания и загрязнений, в том числе – микробных загрязнений. Гранулы практически невозможно подвергнуть маркировке, что затрудняет определение происхождения спермы. При оттаивании гранулированной спермы на пунктах искусственного Осеменения необходимо иметь стерильный разбавитель и посуду для него. При набирании оттаянной спермы на стенках ампул и пипеток остается до 15% ее объема. Есть неудобство и из-за необходимости использования двух хладагентов. Все это побуждало вести работы по совершенствованию этого способа и в последующем он был несколько модифицирован.

Так, Н. Ющенко, В. Семаков и К. Левин (1968) предложили проводить замораживание спермы на фторопластовых пластинах, предварительно охлажденных в жидком азоте (рис. 44). При правильном обращении с пластинами гранулы после затвердения легко удаляются из лунок. С внедрением пластин в практику отпала необходимость в применении двуокиси углерода, что еще более повысило экономичность способа. Однако остается главный недостаток способа — незащищенность спермы от внешней среды. Кроме того, на многих предприятиях, где используется этот способ, нет единого технологического процесса получения, обработки, хранения и использования спермы.

У силия в направлении устранения этих недостатков привели к созданию принципиально отличающегося от японского — харьковского способа замораживания спермы быка в облицованных гранулах. Отличительной особенностью этой технологии является то, что сперма с момента ее получения до введения в канал шейки матки самки не соприкасается с внешней средой (рис. 45, 46). Получают сперму в искусственную вагину с одноразовым спермоприемником, в котором имеется специальный чехол-пробирка для отбора пробы эякулята для определения его качества. После деления чехла-пробирки и разбавления спермы непосродственно в спермоприемнике муфту спермоприемника соединяют с полимерной трубкой диаметром 3,8-4 мм с толщиной стенки 120 мкм и вдавливают в нее разбавленную сперму. Заполненную трубку разрезрезают так, чтобы в каждом отрезке размещалось 0,2-0,3 спермы. Разрезают при помощи аппарата АРЖ, который одновременно и герметизирует отрезки. После замораживания в жидком азоте получают облицованные пленкой (герметизированные) порции спермы (гранулы).

Хранение спермы других видов животных при низких температурах также разработано, однако практикуется значительно реже. Сперму барана замораживают на поверхности сухого льда или на охлажденной до -80°С фторопластовой пластине. Замораживание спермы жеребца проводят или в гранулах, или в алюминиевых пакетах по 13 мл (рис. 47).

С охранение спермы при помощи химических средств. Известно, что в канале придатка семенника, несмотря на высокую температуру (близкую к температуре тела животного), спермин находятся в малоактивном состоянии, уровень обмена веществ в них очень низкий и они в течение месяца и более могут сохранять оплодотворяющую способность. Связано это, главным образом, со слабокислой средой в канале придатка семенника, отсутствием в среде электролитов и свободного кислорода. Спермин в бескислородной среде живут дольше, чем в присутствии кислорода. Если сперму покрыть слоем вазелинового масла, то аэрация ограничивается, снижается уровень окислительных процессов, и это удлиняет продолжительность жизни спермиев. Накопление молочной кислоты и понижение рН способствует замедлению, а затем и полностью останавливает подвижность спермиев и содействует переводу их в анабиотическое состояние. Тормозится подвижность спермиев и в гипертонических солевых растворах. При подщелачивании среды и повышении ее температуры или при добавлении воды в гипертонический раствор спермин восстанавливают свою подвижность. Причем для перевода клеток в активное состояние температура должна быть тем выше, чем ниже рН. Так, в слабощелочной среде (рН 7,6) спермин двигаются при температуре 15-20°С, а при рН 6 движение их проявляется только при 35-4СГС. При рН 4,5 одного повышения температуры уже недостаточно, чтобы вывести спермиев из анабиоза; требуется одновременное повышение температуры и подщелачивание среды. Длительное воздействие на спермиев среды с более низким значением рН приводит к их гибели. Слабые органические кислоты проявляют губительное действие и при рН выше 5. Так, при температуре 4°С молочная кислота может необратимо иммобилизовать спермиев уже при рН 6.

П ринцип кислотного анабиоза в сочетании с регулированием температуры был использован при разработке метода кратковременного хранения спермы путем применения угольной кислоты. Эта кислота легко улетучивается при доступе воздуха, рН повышается, и это способствует восстановлению активности спермиев.

К.Н.Кржижковский и Г.П.Павлов (1924) помещали сперму собаки в стеклянные капилляры и закрывали их воском. В результате дыхания накапливалась угольная кислота, которая через 30-40 мин замедляла, а затем полностью тормозила движение спермиев. В таком состоянии сперму хранили при 10°С до 6 сут. При вскрытии капилляров и помещении спермы на стекло угольная кислота улетучивалась и спермин восстанавливали свою подвижность.

Попытку практического применения этого способа хранения спермы сделали Шергин и Несмеянова в 1940 г. Они хранили сперму барана в течение 4 дней при 15-20°С, прибавив к ней порошок мела. Мел нейтрализовал молочную кислоту и выделялась угольная кислота, благодаря которой и поддерживалась слабокислая реакция (рН 6,2-6,4). В опыте с использованием овец романовской породы после осеменения такой спермой объягнилось 53% маток, а при осеменении свежеполученной спермой – 56%. На овцах породы прекос получены более низкие результаты – объягнилось 39% осемененных животных.

Больших успехов в сохранении спермы быков посредством кислотного анабиоза достигли ВанДемарк и Шарма (1956-1957). Ими была разработана специальная среда – ИВТ (Иллинойская для варьирующих температур). Перед использованием среду насыщали углекислым газом, затем добавляли антибиотики и желток куриного яйца. Сперму разбавляли в 40 раз и разливали в ампулы по 2,2 мл, запаивали и хранили при 18-28°С. При подогревании спермин восстанавливали свою подвижность. При использовании такой спермы в течение 3 сут оплодотворяемость была примерно такой же, как и при осеменении охлажденной до +5°С спермой (50-70%); при недельном сроке хранения оплодотворяемость колебалась от 30 до 50%, а при 2-недельном – только 30%.

В связи с разработкой метода длительного хранения спермы в жидком азоте метод кислотного анабиоза был забыт. Однако подавление метаболизма в спермиях для продления их жизни химическим путем полностью не утратило своего значения. В настоящее время введением в среды для разбавления спермы хряка натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, трилон Б) резко снижают содержание ионов кальция, что способствует снижению метаболизма в спермиях и обеспечивает сохранение оплодотворяющей способности спермы в течение нескольких дней при температуре 16-20°С.

В Новой Зеландии широко применяется хранение спермы быка при комнатных температурах в сочетании с высокими степенями разбавления спермы. Разбавляют сперму средой, содержащей глицерин и капроновую кислоту, которые понижают метаболизм в сперматозоидах.

СИНТЕТИЧЕСКИЕ СРЕДЫ ДЛЯ РАЗБАВЛЕНИЯ И ХРАНЕНИЯ СПЕРМЫ

Цель разбавления спермы. Сперму разбавляют, чтобы увеличить ее объем и осеменить больше самок, а также чтобы поддерживать генетически обусловленный уровень ее оплодотворяющей способности на протяжении всего срока хранения.

При использовании неразбавленной спермы одним эякулятом можно осеменить 20-30 коров (при минимальном объеме вводимой спермы 0,2 мл), 2-3 свиноматки (по 100 мл на животное), 10-15 овец (объем дозы 0,05-0,1 мл), 3-4 кобылы (по 20-25 мл). После разбавления при современной технике одним эякулятом быка можно осеменить до 500 коров и телок, эякулятом барана – 20-30 овцематок, эякулятом хряка – 8-12 свиноматок, эякулятом жеребца – 10-15 кобыл. Разбавленную сперму в зависимости от типа синтетической среды и метода хранения можно выдерживать в течение нескольких дней или даже нескольких лет. Неразбавленную сперму сохранить в течение длительного срока значительно труднее.

Хорошая среда для разбавления должна отвечать следующим требованиям:

• поддерживать соответствующее равновесие минеральных веществ, необходимых для жизнедеятельности спермиев, и иметь осмотическое давление, изотоничное крови самца;

• обеспечивать спермиев веществами для метаболических процессов;

• содержать источник редуцирующих веществ, способных предотвратить разрушение антатглютина и ферментов спермиев с сульфгидрильными группами;

• иметь защитные средства против токсических продуктов метаболизма спермиев;

• содержать липопротеиды или лецитин для предотвращения температурного шока;

• содержать антибактерильные вещества для предупреждения развития микроорганизмов, вредных для спермиев и полового тракта самок;

• предотвращать или ослаблять губительное влияние на спермиев процессов, происходящих в замораживаемой или оттаиваемой сперме.

К отдельным средам предъявляются и другие требования. В состав сред включают следующие компоненты:

• углеводы (глюкоза, лактоза, фруктоза, раффиноза, сахароза) или вещества-неэлектролиты (гликокол);

• минеральные вещества (натрий лимоннокислый, трехзамещенный, пятиводный; калий фосфорнокислый, однозамещенный; натрий двууглекислый; магний сернокислый; натрий хлористый; калий хлористый; аммоний сернокислый; лимонная кислота; двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилон Б, хелатон); трис-буфер и др.;

• желток куриных яиц;

• глицерин;

• сульфаниламиды и антибиотики;

• вода дистиллированная (бидистиллированная);

• ферменты, загустители или другие вещества (молоко).

Все компоненты должны отвечать требованиям фармакопеи, иметь этикетки с указанием предприятия, выпускающего реактив, названия и степени чистоты ("ЧДА" – чистый для анализа, "ХЧ" – химически чистый), номера контрольного анализа и быть проверенными на безвредность для спермиев животных. Хранить реактивы необходимо в сухом месте, в стеклянных банках, плотно закрытых притертыми стеклянными или корковыми пробками и залитых сверху парафином, или в запаянных полиэтиленовых мешочках. Вода должна быть нейтральной реакции и поэтому к качеству дистиллятора (бидистиллятора) предъявляются особые требования.

Углеводы. Включать сахара в среды для разбавления спермы предложил Э.Ф.Поярков (1917). Им впервые отмечены защитные их свойства, которые особенно ярко проявлялись в щелочных средах. Последующими работами В.К.Милованова и других авторов роль Сахаров для сохранения жизнедеятельности спермиев раскрыта более глубоко и полно. Бедные электролитами сахарные среды инактивируют антитела (спермолизи-ны) и защищают спермиев от агглютинации, т.е. от склеивания их головками или всем телом в результате потери отрицательного электрического заряда, который они приобретают в канале придатка семенника вместе с липопротеидной оболочкой.

Существование изо- и гетероспермиоагглютининов было доказано Е.С.Лондоном. Образование спермио-агглютининов происходит в ответ на парентеральное проникновение белков спермы. Обратимая, "звездчатая" агглютинация может происходить и вследствие увеличения в сперме количества водородных ионов при накоплении молочной кислоты. В естественных условиях агглютинации спермиев в семенной жидкости и в половых путях самки препятствуют антагглютинины, которые содержатся в секрете предстательной железы и в фолликулярной жидкости.

Сахара (глюкоза, фруктоза) могут быть использованы спермиями для метаболических процессов. При добавлении к сперме глюкозы дыхательный коэффициент (молярное отношение выделенной углекислоты к поглощенному кислороду) повышается. Это является доказательством интенсивного использования сахара. Однако благоприятное действие Сахаров на спермиев связано не только с этим. Для сред жеребца, хряка, кролика, собаки оптимальное количество сахара довольно велико, хотя только ничтожное количество его может быть использовано. А сперма быка и барана в своем составе содержит много фруктозы, которая также может использоваться в течение нескольких часов. Но внесение дополнительного сахара оказывает немедленный эффект. Причем такое действие проявляют не только те сахара, которые могут быть включены в реакции метаболических процессов, но и нерасщепляемые спермиями сахароза, арабиноза и др.

Более того, замена сахара аминоуксусной кислотой (глицином, гликоколом) не ухудшала свойства среды для разбавления спермы. Гликокол, как и сахар, является слабым электролитом. Введение одного из этих веществ в синтетическую среду снижает ее электропроводность, защищает спермиев от потери отрицательного электрического заряда и агглютинации.

Сахара являются источником редуцирующих веществ. Воспринимая кислород и окисляясь, они могут выполнять роль антиоксидантов и предохранять антагглютинин и ферменты, содержащие сульфгидрильную группу, от окисления. Сахара увеличивают вязкость среды и устойчивость к развитию гнилостных микроорганизмов, что также благоприятно отражается на переживаемости спермиев. Кроме того, они способны задерживать воду или заменять ее в структурах, чувствительных к дегидратации.

Минеральные вещества. В чистых солевых разбавителях при комнатной температуре в аэробных условиях спермин обладают высокой подвижностью. Сохраняется она до тех пор,, пока разбавитель насыщается кислородом и имеется соответствующий субстрат для метаболических процессов. Но так как простой физиологический раствор не обладает буферной способностью, то при отсутствии кислорода накапливаются кислые продукты гликолиза, и спермин погибают вследствие понижения рН. В чистом виде солевые растворы Для разбавления не используются. В состав сред они включаются в таких пропорциях, чтобы в комплексе с Другими компонентами обеспечить необходимые осмотическое давление ирН, уменьшить интенсивность биохимических реакций в спермиях при температурах выше 0°С и сохранить жизненно важные структуры клетки.

Наиболее благоприятное влияние на спермиев оказывают неядовитые соли с многовалентными анионами; увеличение валентности имеет положительный эффект. В отношении катионов обнаружена обратная зависимость - соли с двухвалентным катионом (кальция, магния и др.) вызывают агглютинацию спермиев, а с трех- или четырехвалентными катионами - коагуляцию. Главное значение солей в средах для разбавления спермы заключается в замедлении набухания оболочки и цитоплазмы спермиев под влиянием многовалентных анионов.

Первые наиболее удачные результаты применения сред для разбавления спермы, в основе которых был солевой раствор, получены Филлипсом (1939). Им использована среда, состоящая из одной части фосфатного буфера (Na₂HP0₄х12Н₂0 – 2 г и КН₂РО₄ – 0,2 г на 100 мл дистиллированной воды, рН 6,7-6,8) и одной части желтка куриных яиц. Разбавленная этой средой сперма не теряла оплодотворяющей способности в течение 180 ч при хранении при 5°С. В последующем фосфатный буфер был заменен раствором натрия цитрата, который повышал результаты осеменения сохраняемой спермой.

Натрия цитрат (Na₃C₆H₅0₇х5H₂0) обладает хелатными свойствами, активно связывает ионы кальция и тяжелых металлов. В сперме кальция содержится 5-15 мг-ионов в л, что в 20-60 раз больше, чем в крови. Это неблагоприятно сказывается на переживаемости спермиев во внешней среде, способствует их агглютинации. Внесение этой соли в синтетическую среду обеспечивает снижение свободных ионов кальция до оптимального уровня. Кроме того, натрия цитрат рассеивает жировые шарики в желтке так, что при оценке разбавленной спермы под микроскопом можно наблюдать за отдельными спермиями. Буферные же свойства натрия цитрата в зоне рН 6,0-8,0 очень слабы. Чистые растворы его имеют рН 7,8-8,0.

Введение в состав синтетических сред нитрата, фосфата, тартрата, сульфата, бикарбоната дает хорошие результаты благодаря их способности понижать в среде количество свободных ионов кальция. Это послужило основанием проводить обескальцивание разбавленной спермы более энергично путем внесения натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты. Эта соль относится к числу хелатных соединений, в которых металл связывается как обычными валентностями с карбоксильными группами, так и побочными валентностями с аминогруппами. В кальциевых солях атом кальция оказывается прочно связанным, но не в осадке, а в растворимом комплексе. Обескальцивание среды существенно сказывается на уровне метаболических процессов в спермиях. В средах для хранения спермы хряка при комнатных температурах трилон Б является одним из наиболее важных компонентов.

При приготовлении сред для спермы барана большое значение предается их буферным свойствам и величине рН. Наиболее подходящей буферной системой является К-трис(гидроксиметил)метил-2-аминоэтан сульфониковая кислота (TEG) с трис-буфером. Трис-буфер (2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол) устойчиво удерживает первоначальную величину рН среды, обладает осмотическим действием, хорошо проникает через клеточную мембрану. Он способен соединяться с Н+ и СО2 и устранять явления дыхательного ацидоза клеток и может заменить в средах глюкозу и цитрат натрия.

Желток куриных яиц. Впервые защитное действие липидов различного происхождения (из желтка куриных яиц, желтого тела, семенников, соевых бобов, мозга) на спермиев было установлено В.К.Миловановым и О.А.Селивановой (1932). Введенные в среду липиды полностью предохраняли спермиев от температурного шока. В последующем было доказано, что наибольшим защитным действием наряду с лецитином желтка обладают комплексы фосфолипидов с белком – липопротеиды.

Желток яиц содержит глюкозу. Она используется спермиями раньше, чем фруктоза, содержащаяся в сперме. В желтке имеются различные протеиды, водорастворимые и жирорастворимые витамины, каротин, холестерин и другие вещества, которые стимулируют активность дегидрогеназ спермиев. Ряд других веществ и соединений могут служить в качестве окислительных субстратов, предохраняющих сульфгидрильные группы ферментов и антагглютинин от разрушения. Желток имеет кислую реакцию (рН 6,0-6,3). Обычно она нейтрализуется введением в среду лимоннокислого натрия.

Практическое применение желтка в средах для разбавления спермы началось после сообщения Филлипса. Включали желток в соотношении 1:1 к фосфатному или цитратному буферу. Уменьшение его количества всегда приводило к снижению переживаемости спермиев. Это было связано с тем, что малые количества желтка не могли смягчить гиперосмотическое действие используемого тогда цитрата. Когда же стали больше обращать внимание на осмотическое давление буферов, то оказалось возможным снизить содержание желтка до 12,5-20% в средах для спермы быка и барана. В средах для спермы жеребца, хряка и кролика такие количества являются чрезмерными, так как действуют неблагоприятно. Оптимальным количеством для спермы хряка и кролика является 3-5%, для спермы жеребца - менее 1% желтка.

Глицерин вводится в среды для замораживания спермы. Это – простейший трехатомный спирт; смешивается с водой или этиловым спиртом в любых пропорциях. При охлаждении до -196°С затвердевает без образования кристаллов льда. Таким же свойством обладают и растворы с концентрацией 70% и более. Причем при замерзании глицерина и его растворов их объем уменьшается. Введение глицерина в среды для разбавления спермы уменьшает опасность образования кристаллов льда и механического повреждения ими спермиев, снижает давление на клетки и препятствует сильному повышению концентрации растворенных веществ при образовании кристаллов льда из воды. Глицерин спермиями используется для образования энергии путем окисления, а в аэробных условиях восполняет содержание фруктозы.

Защитные свойства глицерина при замораживании спермы до -21°С впервые были доказаны А.Д.Бернш-тейном и В.В.Петропавловским (1936). Глицерин в концентрации 9,6% предохранял спермии от гибели при многочасовом хранении при этой температуре. Однако только после работ С.Полджа, О.Смита и О.Паркса (1948) глицерин стали использовать как важный компонент синтетических сред для разбавления спермы животных. Вносится он в количестве от 3 до 10 мл на 100 мл среды.

Антимикробные вещества. При хранении спермы возможно развитие в ней микроорганизмов. Попадают они в момент получения или обработки спермы. Размножаясь, микроорганизмы выделяют в среду продукты обмена, которые отрицательно сказываются на переживаемости спермиев. При осеменении внесенные со спермой в половые пути самки микроорганизмы могут препятствовать оплодотворению или развитию беременности. Особенно большую опасность представляет загрязнение спермы возбудителями специфических половых инфекций. Для предупреждения размножения микроорганизмов в сперме и инфицирования спермы вносят сульфаниламиды и антибиотики.

Наиболее эффективными и безвредными для спермиев являются стрептоцид белый растворимый, пенициллин и стрептомицин. Стрептоцид вносится в среды в количестве 0,12-0,14 г на 100 мл среды. Сульфаниламид также снижает интенсивность гликолиза и удлиняет срок жизни спермиев. Пенициллин и стрептомицин вводятся в количестве 25-30 тыс. ЕД на 100 мл среды. На основе этих трех антибактериальных веществ создан препарат спермосан-3, который широко используется в работе племпредприятий. Однако этот препарат, также как и стрептомицин в отдельности, не является абсолютно нетоксичным для спермиев. В.А.Серединым (1980) предложен новый препарат комбиспермосан-ЛАП, состоящий из левомицетина сукцигната натрия – 500-750 мкг/мл, ампициллина натрия – 1000 мкг/мл и полимиксина "М" или "В" сульфата – 1000 ЕД/мл. В средах с комбиспермосаном значительно Улучшается биологическое и санитарное качество разбавленной спермы. В США и других странах в ряд сред для разбавления спермы вносятся антибиотики гентамицин, тилозин, линкоспектин.

Молоко. Молоко коровье является подходящей биологической средой для разбавления спермы. Достаточно широко использовалось в практике искусственного осеменения для разбавления и хранения спермы быка при температуре около 5°С. Наиболее приемлемо для этой цели гемогенизированное, прогретое при температуре 92-98°С цельное коровье молоко. Во время прогревания разрушается антистрептококковое вещество молока – лактенин, который очень токсичен для спермиев. Кроме того, прогревание при более чем 80°С приводит к освобождению некоторыми протеиновыми фракциями сульфгидрильных групп, которые могут играть роль восстанавливающих агентов, регулирующих метаболические процессы в спермиях. Молоко содержит небольшое количество веществ для метаболических процессов, таких, как глицерин и органические кислоты. Много содержится в молоке лактозы.

Приготовление синтетических сред. В условиях племпредприятий применяют синтетические среды, выпускаемые в виде сухих заготовок или приготовленные из отдельных компонентов непосредственно перед применением. Компоненты сред взвешивают на аналитических или химических весах. В стерильную химическую колбу наливают необходимое количество прокипяченной дистиллированной (бидистиллированной) воды и добавляют минеральные и органические вещества, за исключением санирующих препаратов, глицерина и желтка. Такую "неполную" среду стерилизуют в водяной бане 5-10 мин с момента закипания воды, затем охлаждают до 35-40°С и добавляют спермосан, глицерин, желток. Яйца перед использованием моют, протирают спиртовым тампоном, раскалывают пополам, отделяют желток от белка, перекладывают желток на стерильный лист фильтровальной бумаги, прокалывают оболочку желтка и сливают в измерительную мензурку. Подготовленный желток переносят в колбу с синтетической средой. Колбу со средой накрывают стерильной пергаментной бумагой и фиксируют резиновым кольцом. После тщательного перемешивания среду можно использовать для разбавления спермы. Для поддержания необходимой температуры среду выдерживают в водяной бане или термостате в течение 3-4 ч с момента приготовления.

Качество синтетической среды определяют биологическим путем - по продолжительности выживаемости сперматозоидов при различных разбавлениях спермы, сохраняемой при температуре 2-5°С. Каждая вновь поступившая в лабораторию племпредприятия серия антибактериальных препаратов, сахаров, минеральных веществ и других компонентов, входящих в состав синтетической среды, в обязательном порядке проверяется- таким путем. Биологический контроль позволяет установить оптимальные и токсичные степени разбавления спермы. Оптимальную степень устанавливают по наибольшему абсолютному показателю живучести спермиев.

Основными компонентами синтетических сред для разбавления спермы быка, барана и жеребца и хранения ее при 2-4°С являются Сахара (глюкоза или лактоза), минеральные вещества (натрия цитрат, фосфатно-кислые соли натрия и калия и др.), желток куриного яйца и санирующие препараты (табл. 4). В среды для спермы хряка желток не вводится, так как после разбавления сперма хранится при температуре 16-20°С. При правильном обращении с ней в этих условиях опасность температурного шока отсутствует. Но для снижения уровня метаболических процессов в спермиях в среду помимо натрия цитрата включают трилон Б.

4. Среды для краткосрочного хранения спермы
Компоненты среды	Сперма
	быка	барана		жеребца	хряка
Сокращенное название среды Компоненты: вода дистиллированная, мл глюкоза, г лактоза, г цитрат натрия, г гидрокарбонат натрия, г натрий фосфатнокислый: 12-водный, г безводный, г калий фосфатнокислый однозамещенный безводный, г сульфат аммония, г трилон Б, г желток куриного яйца, мл спермосан-3 (тыс. ВД) Температура хранения раз- бавленной спермы, °С Максимальная продолжи- тельность хранения, ч	ГЦЖ 100 3 1,4 20 75-90 2-5 72	ГЦЖ 100 0,8 2,8 2,8 15-20 25 2-5 24	ГФЖ 100 3,2 2,08 0,82 0,08 15-20 25 2-5 24	ЛХЦЖ 100 - 11 0,089 0,008 0,1 1,6 25-30 2-5 48	ГХЦ 1000 60 3,56 1,2 3,7 250-300 16-20 72	ГХЦС 1000 40 3,8 0,5 1,8 2,6 250-300 16-20 72

Среды для замораживания спермы, как правило, более сложные по составу (см. табл. 5) и приспособлены не только для каждого вида животных, но и для соответствующей технологии расфасовки, замораживания и хранения.

Разбавление и хранение спермы быка. Сперму быка хранят при температуре -19б°С (в жидком азоте), при 0-5°С и при комнатных температурах. Разбавляют ее средами, состав которых зависит от технологии расфасовки и хранения. Многие среды запатентованы. С момента получения спермы от производителя до разбавления должно пройти не более 10 мин. В зависимости от подвижности и концентрации спермиев сперму быка разбавляют так, чтобы в одной дозе при всех способах хранения перед осеменением было 10-15 млн. спермиев с прямолинейным поступательным движением и с подвижностью не ниже 4-7 баллов. Температура синтетической среды перед разбавлением должна быть одинаковой со спермой (27-32°С). Среду осторожно небольшими порциями приливают к сперме, соблюдая правила асептики.

При температуре +2-5°С сперму быка можно хранить в течение 72 ч, разбавив глюкозо-цитратно-жел-точной средой (табл. 4).

В США широко использовалась желточно-фосфатная среда: фосфатный буфер и желток куриных яиц в соотношении 1:1. Фосфатный буфер (рН 6,7-6,8) содержит в 100 мл дистиллированной воды Na₂HP0₄х12Н₂О – 2 г и КН₂Р0₄ – 0,2 г. Смесь подогревается в кипящей водяной бане до растворения солей. Хранится при температуре 15°С. Перед использованием добавляют необходимое количество желтка.

Рекомендуется и другая среда: Cornell University Extender: буфер – 80% (объема), желток – 20% (объема), пенициллин – 1000 ЕД/мл и стрептомицин –1000 мкг/мл. Буфер содержит:

Натрия цитрата (Na₃C₆H₅O₁₂ х 2H₂O) 14,5 г

Натрия бикарбоната 2,1 г

Калия хлорида 0,4 г

Глюкозы 3,0 г

Глицина 9,4 г

Лимонной кислоты 0,9 г

Сульфаниламида (стрептоцида) 3,0 г

Дистиллированной воды до 1 л

Хорошие результаты получают при разбавлении спермы молочно-глицериновой средой: 1. Сначала разбавляют сперму средой из цельного гомогенизированного или снятого молока с антибиотиками так, чтобы в дозе количество сперматозоидов было вдвое больше необходимого; медленно охлаждают до 5°С в течение 4 ч.

2. Охлажденную сперму разбавляют повторно 1:1 охлажденной средой, содержащей 20% глицерина; среду добавляют равными порциями или в количестве 20, 30 и 50% с интервалами 10 мин или же в течение 30 мин по каплям. Финальная концентрация глицерина около 10%; хранят сперму при 5°С.

Сперму, сохраняемую при 2-5°С, фасуют в одноразовые стерильные полиэтиленовые ампулы, полиэтиленовые пробирки объемом по 1 мл или флаконы из-под антибиотиков; необходимо их наполнять полностью. Полиэтиленовые ампулы запаивают, а пробирки и флаконы закрывают стерильной нетоксичной пробкой и закрепляют ее резиновым кольцом. На каждой ампуле заранее пишут тушью номер быка и дату взятия спермы. На стеклянные флаконы наклеивают бумажные этикетки. Подготовленные флаконы и ампулы со спермой оставляют при комнатной температуре (18-20°С) на 20-30 мин, упаковывают и помещают в холодильник при температуре 2-5°С или в пищевые термосы со льдом. Хранят в течение трех дней. Используют сперму с активностью не ниже 7 баллов.

В Новой Зеландии широко практикуется хранение спермы в течение трех дней при комнатной температуре (18-24°С). Осеменение скота сезонное – с середины сентября до декабря. Осеменяют ежегодно до 1,8 млн. животных. В 1991 г. спермой быка голштинской породы Crocketts Trevor в течение трех месяцев было проведено 380000 осеменений. Сперма разбавляется нередко из расчета 2 млн. спермиев в дозе (0,5 мл), но чаще ее расфасовывают в соломины объемом 0,25 мл.

Для разбавления спермы используют желточно-цитратную среду. Ее насыщают азотом и добавляют капроновую кислоту. Желток, пенициллин и стрептомицин вводят в среду перед использованием. Содержание желтка после разбавления 5%. Добавление каталазы 20 мкг/мл среды повышает оплодотворяемость на 1-2%. Каталаза разрушает образующуюся в процессе метаболизма спермиев перекись водорода.

Состав буфера:

Лимоннокислый натрий (Na₃C₆H₅O₇ х 2Н₂О) 2,0%

Глюкоза 0,3%

Глицин 1,0%

Глицерин 1,25%

Капроновая кислота 0,03125%

Сульфацетамид 0,01%

Вода дважды дистиллированная до 100 мл

При замораживании спермы в гранулах разбавление проводят лактозо-желточно-глицериновой средой (табл. 5).

Разбавляют сперму одномоментно так, чтобы в одной грануле (0,2 мл) после оттаивания содержалось 10-15 млн. подвижных спермиев. Разбавленную сперму (температура 31± ГС) охлаждают при температуре .2-5"С в течение 4 ч и замораживают на фторопластовых пластинах в специальных прямоугольных или цилиндрических емкостях. Наносят сперму на охлажденную до -160-170°С пластину с помощью охлажденных шприцев, градуированных полиэтиленовых баллончиков от приборов для осеменения свиней, пипеток или разливочной машины, других приспособлений (см. рис. 44). После выдержки в течение 1-2 мин над жидким азотом, а затем в жидком азоте пластину приподнимают до верхнего уровня емкости, охлажденной лопаткой сгребают гранулы в охлажденный контейнер или марлевый мешочек, используя при этом широкую воронку или специальное устройство. Гранулы переносят на хранение в стационарное хранилище.

Для замораживания спермы в соломинках по французской технологии (Кассу) используются среды "Ле-цифос" (477 и 488) и "Криоцифос" (479 и 480).

Сухие заготовки среды "Лецифос" растворяют в би-дистиллированной воде, добавляют желток, после чего разделяют среду на две части. В каждую из них (№1 и № 2) добавляют глицерин, соответственно 3% и 11%.