54. Способы обнаружения в почве шигелл

Ответ. Загрязнение почвы сальмонеллами происходит в результате непосредственного попадания фекалий, преимущественно животных, в меньшей степени — человека. Практически у всех домашних и многих диких животных сальмонеллы обнаружены как комменсалы и как возбудители острых сальмонеллезов. Шигеллы попадают в почву с испражнениями человека. Для определения сальмонелл в почве могут быть использованы два метода: посев в среду накопления и метод коагуляции с последующим высевом на дифференциально-диагностические среды. Первый метод более простой: для обнаружения сальмонелл в подготовленную почвенную суспензию вносят ингредиенты магниевой среды «М» (из расчета объема суспензии), инкубируют при температуре 37°С в течение 18-20ч. Затем делают высев на висмут-сульфитную среду (обычно 3-5 чашек). Идентификация выросших колоний проводится по методике определения сальмонелл. Шигеллы обнаруживают параллельно — посевом в селенитовую среду. При выделении сальмонелл из почвы методом коагуляции и центрифугирования по Фикеру к 500 мл почвенной суспензии добавляют 1,7 мл 10%-ного стерильного раствора сульфата железа и 2 мл 10%-ного стерильного раствора бикарбоната натрия (для подщелачивания, которое способствует коагуляции). Суспензию тщательно взбалтывают и ставят в холодильник на 1 ч для образования хлопьев, прозрачную жидкость сливают, а осадок и надосадочную жидкость с хлопьями переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при 5000 об/мин. После центрифугирования жидкость над осадком сливают, а осадок обрабатывают 1 мл 25%-ного раствора виннокислого калия (добавляя по каплям до полного растворения осадка) и делают высев на чашки с висмут- сульфитным агаром и средой Плоскирева. Параллельно оставшийся осадок заливают желчным бульоном. Посевы помещают в термостат при температуре 37°С. Для выявления сальмонелл из желчного бульона через 5 и 20 ч делают высев на дифференциально-диагностические среды. Дальнейшая идентификация сальмонелл и шигелл ведется по обычной схеме. Для обнаружения сальмонелл и шигелл можно непосредственно исходную почвенную суспензию фильтровать через мембранные фильтры, затем их переносят на дифференциально-диагностические среды для подращивания.

55. Способы обнаружения в почве клостридий столбняка и ботулизма

Ответ. Cl. tetani. Исследуемый материал растирают в ступке со стерильным песком. Из подготовленного материала готовят мазки, красят по Граму. Обнаружение тонких, длинных грамположительных палочек позволяет поставить ориентировочный диагноз и проводить бактериологическое исследование. Часть исследуемого материала засевают в жидкие среды и на чашки с кровяным агаром. Посевы проводят в двойное число пробирок, один набор прогревают при 80 градусах 20 минут. Посевы инкубируют в анаэростате при 37 °. Через 2, 4, 6 и 10 дней пробирки просматривают, из культуры готовят мазки. При обнаружении типичных микробов делают высев на чашки с кровяным агаром для выделения чистой культуры. На поверхности кровяного агара столбнячные палочки образуют нежные прозрачные колонии, похожие на капельки росы, с зоной гемолиза. Колонии быстро разрастаются и образуют нежную сетчатую пленку, покрывающую всю чашку и плохо видимую невооруженным глазом. Культуру и колонии микроскопируют. При обнаружении бактерий, морфологически похожих на столбнячные, часть колонии пересевают на жидкую среду, изучая способность ее вырабатывать экзотоксин. Присутствие токсина в культуральной жидкости определяют в реакции нейтрализации на мышах или в РНГА. Cl. Botulinum. В поле зрения видны крупные полиморфные грамположительные палочки с овальными спорами, расположенными субтерминально. Диаметр спор превышает диаметр палочек, поэтому палочка со спорой имеет вид теннисной ракетки. Для выделения чистой культуры палочек ботулизма часть материала засевают в пробирки или флаконы в большой объем жидкой питательной среды (чтобы хватило на все исследования): бульон Хоттингера с 0,5% глюкозой или казеиново-грибную среду. Для регенерации кислорода среды перед посевом кипятят. После посева часть пробирок или флаконов прогревают при 60 и 80 градусах для уничтожения аэробной флоры. После этого все флаконы помещают в анаэростат: непрогретый и прогретый при 60 градусах инкубируют при 28 градусах для обнаружения Cl.botulinum типа E, F, непрогретый и прогретый при 80 градусах инкубируют при 35 градусах для обнаружения Cl.botulinum типов А, В и С. Через 48 часов посевы исследуют на наличие возбудителей ботулизма. Обращают внимание на интенсивность газообразования. Из культур готовят мазки, красят их по Граму и микроскопируют. При обнаружении микробов, сходных по морфологии с Cl.botulinum, в культуральной жидкости определяют наличие токсина в реакции нейтрализации, сначала с поливалентной сывороткой. При положительном результате реакцию повторяют с каждой сывороткой в отдельности. Для выделения чистой культуры из исследуемого материала его засевают или в высокий столбик сахарного агара, или на чашки с кровяно-сахарным агаром. Инкубируют в анаэростате при 35–37 градусах в полном вакууме. Через сутки на кровяном агаре вырастают прозрачные, в виде росинок, дымчатые колонии, окруженные зоной гемолиза. В столбике агара вырастают колонии в виде комочков ваты, пушинок или правильных дисков. Подозрительные колонии отсевают на сахарный бульон, выросшие культуры изучают в мазках, окрашенных по Граму, на способность ферментировать углеводы и белки, определяют токсигенность в реакции нейтрализации.