1. Получение и обработка испытуемой сыворотки

Кровь для исследования берут по общепринятой методи­ке. Исследуемые по РСК сыворотки предварительно под­вергают инактивации путем нагревания на водяной бане при +56—58° в течение 30 мин в день постановки реакции.

2. Приготовление 2,5% взвеси эритроцитов

Кровь берут из яремной вены барана в банку со стеклян­ными бусами. Дифибринируют кровь путем встряхива­ния в течение 10—15 мин, затем ее фильтруют через 2—3 слоя марли, разливают по центрифужным пробиркам, до­бавляют физиологический раствор и центрифугируют в те­чение 10—116 мин при 1500—2000 об./мин. Отмывают эри­троциты 3—4 раза до получения прозрачной жидкости над осадком эритроцитов. Последнюю промывную жидкость тща­тельно отсасывают, а из осадка берут 2,5 мл эритроцитов и 97,5 мл физиологического раствора. Получают 2,5% раствор.

3. Приготовление гемолизина

Гемолизин изготовляют на биофабриках. Гемолизин (ге­молитическую сыворотку) получают путем иммунизации кро­ликов. Для этого кроликам многократно вводят подкожно, а чаще внутривенно, отмытые эритроциты барана, в нараста-

51

ющем количестве с интервалом в 2 дня. Например: 1-е вве­дение — 0,26 мл осадка эритроцитов в 2,5 мл физраствора, 2-е — 0,5, 3-е — 0,75 и т. д.

На 3—5-й день после последней инъекции эритроцитов у кроликов берут кровь для предварительного определения ти­тра. Если титр сыворотки не менее 1:2000, то в этот день кроликов обескровливают.

Консервируют полученную от этих кроликов сыворотку чистым стерильным глицерином; через 2—3 дня определяют титр консервированных сывороток от каждого кролика в отдельности,

4. Приготовление комплемента

В качестве комплемента берут свежую сыворотку крови морской свинки. Кровь от морских свинок можно получать разными способами.

Пункция сердца. Свинку фиксируют на столе в спино-бо-ковом положении. Большим и указательным пальцами левой руки прощупывают с обеих сторон грудную клетку, по толч­кам определяют положение сердца. Правой рукой вводят в грудную полость иглу шприца. От взрослой свинки берут 5—16 мл крови. Полученную кровь помещают на 15—20 мин в термостат. После свертывания крови сыворотку отсасыва­ют и сохраняют для использования в качестве комплемента в леднике.

5. Приготовление антигена

При изготовлении антигена отбирают наиболее вирулент­ные штаммы микробов, засевают на печеночный агар и вы­ращивают в термостате при температуре +37°С. После 2— 3-суточного роста культуры проверяют макро- и микроско­пически на чистоту. Отобранные матрицы смывают физиоло­гическим раствором с 0,5% карболовой кислоты. Получен­ную взвесь микробов фильтруют и подвергают кипячению в водяной бане 30 мин, далее отстаивают 2—3 дня. Жидкость удаляют, а бактерийную массу разводят физиологическим раствором с 0,5% карболовой кислоты до концентрации 40 млрд. микробных тел. Полученную взвесь выдерживают в течение 3 месяцев, затем жидкость отделяют центрифугиро­ванием и используют в качестве антигена.

52

Определение титра гемолизина. Титрование производится для определения предельной гемолизирующей способности гемолизина.

Титром гемолизина называется минимальное его количе­ство, необходимое для полного гемолиза 0,5 мл взвеси эри­троцитов в присутствии комплемента при температуре +37— —38°С в течение 10 мин.

Для .титрования необходима иметь пробирки, пипетки термостат, штатив, физраствор, гемолитическую сыворотку, из которой нужно приготовить основное разведение гемолизи­на.

Получение основного разведения. Берется 0,1 мл гемоли­зина и 9,9 мл физраствора. Получается основное разведение 1:100,

Получение разведений гемолизина. Разведение гемолизи­на от 1:200 до (1:2500 производится по схеме Ь Титрование гемолизина производится по схеме \2. (Каждого разведения берется по 0,6 мл в отдельную пробирку. В каждую пробир­ку добавить по 1 мл физраствора, по 0,5 мл комплемента и по 0,5 мл эритроцитов. Кроме этого, ставится контроль в 3 пробирки.

Пробирка № 13 — контроль гемолизина.

Пробирка № 14 — контроль комплемента.

Пробирка № 15 — контроль физраствора.

Штатив с пробирками ставят в водяную баню на 10 мин. Через '10 мин находят наибольшее разведение гемолизина, при котором произошел полный гемолиз эритроцитов. Это разведение и будет титром гемолизина. Например, он будет равен 1:600. Для проведения титрования остальных компо­нентов PСK берется двойное количество гемолизина. Это удвоенное количество гемолизина называется рабочим тит­ром.

Титрование комплемента. Титром комплемента называет­ся наименьшее количество комплемента, необходимое для полного гемолиза 0,5 мл взвеси эритроцитов при рабочей дозе гемолизина и 10-минутного нахождения ингредиентов в водяной бане при температуре +37—+38°С.

Методика титрования комплемента. Титрование произ­водят по схеме 3. В штатив ставят 8 пробирок и в каждую из них наливают по 0,5 мл гемолизина в рабочем титре, комплемента и физраствора и по 0,6 мл взвеси эритроцитов. Штатив ставят на 10 мин в водяную баню при +38°С. Пер­вая пробирка в штативе с гемолизом и будет тем количеством

53

1. Схема разведения гемолизина

Берется гемолитической сыворотки в разведении 1:100

Прибавляется физраствор

Получается гемолитическая сыворотка в разведении

0,5 0,5 1:200

0,25 0,75 1:400

0,2 1 1:600

0,2 1,4 1:800

0,1 0,9 1:1000

0,1 1,1 1:1200

0,1 1,3 1:1400

0,1 1,5 1:1600

0,1 1,7 1:1800

0,1 1,9 1:2000

0,1 2,4 1:2500

2. Схема титрования гемолизина

№ пробирки

Разведение гемолизина

Кол-во взятого комплемента, мл

Физ. р-р, мл

Взвесь эритроцитов, мл

1 1:100 0,5 0,5 1,0 0,5

2 1:200 0,5 0,5 1,0 0,5

3 1:400 0,5 0,5 1,0 0,5

4 1:600 0,5 0,5 1,0 0,5

5 1:800 0,5 0,5 1,0 0,5

6 1:1000 // // // //

7 1:1200 // // // //

8 1:1400 // // // //

9 1:1600 // // // //

10 1:1800 // // // //

11 1:2000 // // // //

12 1:2500 // // // //

13 К-ль гемолизина

1:100 0,5 --- 1,5 0,5

14К-ль комплемента --- 0,5 1,5 0,5

15К-ль физ. рра --- --- 2,0 0,5

комплемента, которое необходимо для постановки реак­ции связывания комплемента.

54

Постановка реакции связывания комплемента. Сущность реакции состоит в том, что антиген с соответствующим ему антителом извлекает из сыворотки морской свинки содержащийся в ней комплемент и связывает его (адсорбирует).

3. р

3. Схема титрования комплемента

№ пробирки

Гемолизин в рабочем титре

Комплемент, мл

Физ. р-р, мл

Взвесь эритроцитов, мл

1 0,5 0,15 1,35 0,5

2 0,5 0,2 1,3 0,5

3 0,5 0,25 1,25 0,5

4 0,5 0,3 1,2 0,5

5 0,5 0,35 1,15 0,5

6 0,5 0,4 1,1 0,5

7 0,5 0,45 1,05 0,5

8 Контроль комплемента

нет 0,45 1,55 0,5

4.Схема постановки реакции связывания комплемента

№ про-бирки

Испы-туемая сыво-ротка

Антиген

Комп-лемент

Ставится в водяную баню на 10 мин

Гемо-лизин

Эрит-роциты

Физ. Р-р

1 0,5 0,5 0,35 0,5 0,5 0,15

2 0,5 0,5 0,35 0,5 0,5 0,15

3 контроль --- --- 0,5 0,5 1,5

4 контроль --- 0,35 --- 0,5 1,65

5 контроль --- --- --- 0,5 2,0

Вопросы по теме

1. Принципы приготовления компонентов реакции связы-­ вания комплемента (РСК) и основные этапы ее проведения.

2. Чем обусловлена специфическая и неспецифическая ре­ активность?

55

ПАТОЛОГИЯ ТЕПЛОВОЙ РЕГУЛЯЦИИ