Реакция радиального гемолиза в геле.

Реакция радиального гемолиза в геле - это вариант реакции гемолиза и РСК в геле. Эту реакцию ставят в лунках геля из агара, содержащего эритроциты барана и комплемент. После внесения в лунки геля гемолитической сыворотки вокруг них, в результате радиальной диффузии антител, образуется зона гемолиза. Таким образом, можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки. Если в гель добавить эритроциты, на которых адсорбированы антигены различных возбудителей (вирусов гриппа, краснухи и т.д.), а в лунки вносить сыворотки больных, то антитела сыворотки взаимодействуют с вирусными антигенами на эритроцитах, после чего к этому комплексу присоединяется компле­мент и наступает гемолиз в агаре.

Реакция локального гемолиза в геле предложена Н.Йерне (1963 г.) - ее применяют для подсчета клеток - антителопродуцентов.

Клетки, продуцирующие антитела (например, плазмоциты селезенки, после иммунизации животного эритроцитами барана), вносят вместе с эритроцитами барана в гель (агар). Затем в реакционную систему вносят комплемент (наслаивая его на агар) и наблюдают образование зон гемолиза вокруг каждой клетки, образующей антитела к эритроцитам барана. Метод получил распространение во многих областях экспериментальной иммунологии, т.к. дает возможность оценить образование антител на уровне отдельных тканей и клеточных популяций иммунной системы после различных воздействий.

Реакции с применением меченых антител и антигенов - составляют основу современных методов экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, благодаря высокой чувствительности этих методов, позволяющих определять минимальные количества антигенов (антител) в исследуемом материале (нанограммы).

Иммуноферментный метод (анализ) - ИФА - выявление антигенов (или антител) с помощью соответствующих им антител (антигенов), конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой, вгалактозидазой или щелочной фосфатазой).

Наиболее распространен твердофазный ИФА, когда один из компонентов иммунной реакции (антигены или антитела) сорбирован на твердом носителе, например, в лунках полистироловой планшеты. Для выявления антител известный антиген адсорбируют в лунках планшеты, затем вносят исследуемую сыворотку, в которой хотят обнаружить антитела к данному антигену. После инкубации лунки промывают для удаления несвязавшихся белков и вносят в них антииммуноглобулиновые антитела, меченные ферментом (обычно пероксидазой). После инкубации и отмывания в лунки добавляют специфичный для фермента субстрат (перекись водорода) и хромоген (орто - фенилдиамин) для регистрации конечных продуктов расщепления субстрата. По изменению цвета и интенсивности окраски раствора судят о наличии и количестве антител. Если необходимо определить в исследуемом материале антиген, тогда в лунку с сорбированными антителами вносят исследуемый материал, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченую ферментом, и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. Измерение количества продуктов реакции ИФА проводится в автоматизированном варианте в приборах - ридерах с помощью спектрофотометра или автоматических ридерах, измеряя оптическую плотность растворов в лунках при определенной длине волны.

К настоящему времени созданы многочисленные модификации базовой методики ИФА: конкурентные методы ИФА, сэндвич-ИФА (метод Двойных антител для определения антигена) и др. Для постановки ИФА выпускаются специальные тест-системы с набором всех необходимых ингредиентов.

Методы ИФА обладают высокой чувствительностью и специфичностью и получили широкое распространение в различных областях биологии и медицины. ИФА используется для определения антигенов или антител при различных бактериальных, вирусных и протозойных инфекциях, в частности при диагностике ВИЧ-инфекции. ИФА применяется также для

определения концентрации лекарственных препаратов, гормонов, цитокинов в организме, присутствия в нем раковых клеток, гельминтов.

Иммуноблотинг (от англ. "blot" - пятно) - метод идентификации антигенов (или антител) с помощью известных сывороток (или антигенов). Представляет собой сочетание гель - электрофореза с ИФА.

Первоначально методом электрофореза выделяют все антигены вируса и получают коммерческий реагент на специальной нитроцеллюлозной пленке.

При постановке иммуноблотинга на пленку с известными антигенами наносится исследуемая сыворотка пациента. После инкубации и отмывания несвязавшихся антител, приступают к ИФА - на пленку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченную ферментом и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов антиген-антитело, на носителе появляются окрашенные пятна. Метод иммуноблотинга позволяет обнаружить антитела одновременно на все антигены возбудителя. Поэтому его проводят часто для подтверждения предполагаемого диагноза (например, при ВИЧ инфекции), выставленного на основании положительной реакции обычной ИФА (т.е. с каким-либо одним антигеном), что позволяет избежать диагностических ошибок из-за случайных совпадений.

Радиоиммунный анализ (РИА)

Принцип радиоиммунного анализа (РИА) основан на выявлении комплекса АГ-АТ, в котором один из иммунореагентов был мечен радиоактивным изотопом. Обычно используют изотопы йода (¹²⁵J или¹³¹J). Учет реакции проводят с помощью специальных счетчиков ß или γ-излучения. Метод высокочувствителен, но постепенно вытесняется иммуноферментным анализом, учитывая небезопаснось работы с радиоактивными изотопами и необходимость в сложном регистрирующем оборудовании.

Кожные пробы

Для определения гиперчувствительности (аллергии) к антигенам-аллергенам у людей проводят провокационные тесты. Суть их в том, что соответствующий аллерген вводят в организм, чаще всего внутрикожно или накожно. Иногда сублингвально, ингаляционно или в конъюнктиву глаза. Обычно спустя 30 минут оценивают немедленные аллергические реакции, через 24 - 48 часов - замедленные.

На пыльцевые, пищевые, лекарственные аллергены чаще наблюдаются немедленные кожные (сублингвальные, конъюнктивальные) реакции в виде покраснения и припухлости. С помощью этих реакций можно установить природу аллергена, вызвавшего аллергическое заболевание. Поскольку гетерологичные сывороточные белки при повторном введении могут стать причиной развития анафилактического шока, в основе которого также лежит аллергия немедленного типа, перед введением такого рода иммунных препаратов для выявления аллергии, а вместе с тем для временной десенсибилизации ставится кожная проба с соответствующим аллергеном.

Реакции замедленной гиперчувствительности развиваются обычно на бактериальные антигены. Поскольку это является результатом ин-фицированности организма, такого рода кожные реакции можно использовать как один из методов диагностики инфекционных заболеваний (туберкулез, туляремия, бруцеллез и др.) и оценки эффективности вакцинации живой противотуберкулезной вакциной. Во всех этих случаях в качестве аллергена используется вытяжка из соответствующих микробов (туберкулин, тулярин, бруцеллин и т.д.). Например, для выявления сенсибилизации к микобактериям туберкулеза чаще всего ставится кожно-аллергическая проба Манту, когда туберкулин РРО вводится внутрикожно.

Для оценки иммунитета против дифтерии используют кожную им-мунобиологическую пробу Шика, а для скарлатины - Дика. В этих пробах используют экзотоксины соответствующих микробов. Реакции основаны на нейтрализации токсина антитоксинами in vivo. При наличии у испытуемого антител они нейтрализуют токсин в коже, поэтому гиперемии не будет (реакция отрицательная). Наоборот, при отсутствии антител, экзотоксин вызывает гиперемию (реакция положительная).

Цели занятия:

1. Изучить принципы и методы постановки реакций лизиса, РСК и твердофазных реакций ИФА, иммуноблотинга и РИА.

2. Изучить принципы и методы постановки кожно-аллергических и кожных иммунобиологических проб и механизм их развития.

3. Уметь интерпретировать результаты серологических исследований и кожных проб.

Учебно-целевые задачи:

Знать:

1. Диагностические реакции антиген-антитело: РСК, ИФА, РИА, иммуноблотинг.

2. Кожно-аллергические реакции для выявления гиперчувствительности немедленного и замедленного типа, кожные иммунобиологичекие реакции для определения антитоксического иммунитета.

Уметь:

1. Оценить результаты постановки РСК, ИФА, кожно-аллергических и иммуно - биологических кожных реакций.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Реакция титрования гемолитической сыворотки. Гемолитическая сыворотка, полученная путем иммунизации кролика эритроцитами барана, перед титрованием разводится (см. схему разведения гемолитической сыворотки). Для постановки опыта титрования гемолитической сыворотки 0,5 мл каждого разведения сыворотки необходимо соединить с 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана (антиген) и 0,5 мл комплемента (свежая сыворотка морской свинки в разведении 1:10). Реакция идет в термостате при 37°С в течение 40 - 60 мин (см. схему титрования гемолитической сыворотки).

Титром гемолитической сыворотки называется то наибольшее ее разведение, которое в количестве 0,5 мл в присутствии 0,5 мл комплемента, разведенного 1:10, растворяет 0,5 мл 3 % взвеси эритроцитов барана в течение 1 часа пребывания в термостате при 37°С. Титр гемолитической сыворотки должен быть не ниже 1:1200.

Титрование комплемента (см. схему) необходимо для определения титра и рабочей дозы комплемента. Для титрования комплемента используется реакция гемолиза. Донорами комплемента являются морские свинки, сыворотка которых разводится 1:5 и используется для установления титра комплемента (разведения от 1:10 до 1:40), к которому добавляется гемолитическая система.

Гемолитическая система состоит из прогретой гемолитической сыворотки, взятой в тройном титре (антитело), и 3 % взвеси эритроцитов (антиген), взятых в равных соотношениях.

Реакция ставится в термостат на 40 мин при t 37°С. Учет реакции проводится по наличию или отсутствию гемолиза (лаковой крови).

Титром комплемента называется его минимальное количество (максимальное разведение), при котором еще происходит гемолиз. Для постановки РСК комплемент берут в рабочей дозе - титр увеличенный на 20-25%.

Постановка основного опыта реакции связывания комплемента (см. схему №4).

Постановке реакции предшествует подготовка всех ингредиентов, так как для постановки РСК они берутся в строго определенных соотношениях.

В качестве антигена используются растворенные антигены бактерий, риккетсий, антигены вирусов, грибов и др. Антигены могут обладать антикомплементарным действием (т.е. способностью инактивировать комплемент), поэтому антиген титруется перед постановкой РСК с помощью реакции гемолиза. Титром антигена считается наибольшая доза его, которая не проявляет антикомплементарного действия, т.е. при которой прекращается задержка гемолиза. Для РСК используют рабочую дозу антигена, которая равна 1/2 его титра.

Исследуемая сыворотка (антитело) инактивируется при 56°С в течение 30 мин. для уничтожения в ней собственного комплемента.

Комплемент титруется и определяется его рабочая доза (см. выше).

Эритроциты барана и гемолитическая сыворотка смешиваются в равных объемах (гемолитическая система), при этом инактивированная гемолитическая сыворотка берется в тройном титре.

Подготовленные ингредиенты реакции делят на две системы: тест-систему (антиген, антитело, комплемент) и индикаторную систему (гемолитическая система). Сначала реакцию ставят в тест-системе (см. схему опыта) и инкубируют ее в термостате t=37°С в течение 45 мин, затем в реакцию вводят индикаторную систему

Если в исследуемой сыворотке содержатся специфические антитела на известный антиген, то образуется комплекс антиген-антитело, на котором адсорбируется комплемент, и гемолиза не произойдет (реакция положительная, гемолитическая система остается мутной). Если в сыворотке нет специфических антител, комплекс антиген-антитело не образуется, комплемент останется свободным после первой фазы ре­акции и адсорбируется комплексом эритроциты-гемолизины, в результате наступит растворение эритроцитов - гемолиз (РСК отрицательная).

ДЕМОНСТРАЦИИ

1. Реакция иммунного гемолиза: титрование гемолитической сыворотки.

2.Титрование комплемента, определение рабочей дозы комплемента.

3. Гемолитическая система.

4. РСК (основной опыт). Положительный и отрицательный результат.

5. Препараты: комплемент, гемолитическая сыворотка, антигены для

постановки РСК.

6. Тест-системы для постановки ИФА.

7. Тест-системы для постановки иммуноблотинга.

8. Таблицы, схемы, рисунки.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

1. Постановка основного опыта РСК с исследуемыми сыворотками (первая и вторая фазы реакции).

2. Учёт результатов РСК, схему и результаты РСК записать в тетрадь.

Схема № 1. Разведение гемолитической сыворотки

№№ пробирок	1	2	3	4	5	6	7
гемолитическая сыворотка в разведении 1:100(мл)	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
физ.раствор (мл)	0.9	1,1	1,4	1,7	1.9	2,4	2.9
полученное разведение сыворотки	1/1000	1/1200	1/1500	1/1800	1/2000	1/1500	1/3000

Схема № 2. Титрование гемолитической сыворотки

№№ пробирок	Гемолитическая сыворотка (мл) из соответствующего разведения	3% взвесь эритроцитов	комплемент в разведении 1:10(мл)	физ. раствор (мл)	Возможный результат
1	0,5 1/1000	0,5	0,5	1,0	полный гемолиз
2	0,5 1/1200	0,5	0,5	1,0	полный гемолиз
3	0,5 1/1500	0,5	0,5	1,0	полный гемолиз
4	0,5 1/1800	0,5	0,5	1,0	неполный гемолиз
5	0,5 1/2000	0,5	0,5	1,0	нет гемолиза
6	0,5 1/2500	0,5	0,5	1,0	нет гемолиза
7	0,5 1/3000	0,5	0,5	1,0	нет гемолиза
8	контроль	0,5	0,5	1,0	нет гемолиза

В термостат 37°С на 40 мин

Схема № 3. Титрование комплемента

№№ пробирок ингредиенты	1	2	3	4	5	6	7	8
комплемент в разв. 1:5	0,3	0,2	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	-
изотонический раствор	0,3	0,4	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,2
количество смеси, удаляемой из проб	0,4	0,4	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	-
получаемые разведения комплемента	1:10	1:15	1:20	1:25	1:30	1:35	1:40	-
гемолитическая система	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4

В термостат 37°С на 30 мин

Схема № 4. Основной опыт реакции связывания комплемента

	О	К	К	К	К	К	К
№№ пробирок ингредиенты (в мл)	1	2	3	4	5	6	7
исследуемая сыворотка в разв.1:5	0,2	-	-	0,2	-	-	-
положительная сыворотка (контроль)	-	0,2	-	-	-	-	-
отрицательная сыворотка (контроль)	-	-	0,2	-	-	-	-
антиген	0,2	0,2	0,2	-	0,2	-	-
изотонич.р-р хлорида натрия	-	-	-	0,2	0,2	0,4	0,6
комплемент в рабочей дозе	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	-
Инкубация на холоде при 0-4°С в течение 18-24 ч или при 37°С в течение 30 мин
гемолитическая система	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Инкубация при 37°С в течение 30 мин
результат

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Реакции иммунного лизиса, разновидности, механизм.

2. Комплемент, его компоненты. Участие в иммунологических реакциях. Активация комплемента по классическому типу

3. Реакции бактериолиза, их биологическая роль, практическое значение.

4. Реакция иммунного гемолиза. Практическое значение.

5. Реакция связывания комплемента (РСК); системы, участвующие в реакции, ингредиенты. Механизм РСК.

6. Подготовка всех ингредиентов для РСК: а) титрование комплемента и установление его рабочей дозы; б) титрование гемолитической сыворотки; в) приготовление гемолитической системы; г) инактивация исследуемой сыворотки; д) титрование антигена.

7. Схема постановки основного опыта РСК. Положительный и отрицательный результат РСК. Практическое применение РСК.

8. Каков принцип постановки твердофазных диагностических иммунологических реакций?

9. Как поставить и учесть результаты ИФА и РИА?

10. Что такое иммуноблотинг, в каких случаях проводится это исследование?

11. Как определить природу аллергена, вызвавшего аллергическое заболевание, в основе которого лежит гиперчувствительности немедленного типа?

12. Каков механизм инфекционной аллергии, в основе которой лежит гиперчувствительности замедленного типа?

13. Как можно выявить инфекционную аллергию и с какой целью проводят ее определение?

14. В каких случаях проводят кожные иммунобиологические реакции (Дика и Шика), о чем свидетельствуют положительные реакции в этих случаях, каков их механизм?

ЗАНЯТИЕ №15

Темы:

• Иммунный статус организма человека.

• Иммунопрофилактика и иммунотерапия болезней человека.

План занятия:

1. Иммунный статус человека и его значение.

2. Тесты для оценки иммунного статуса и методы их определения.

3. Имунобиологические препараты: их классификация, области применения:

• вакцины, анатоксины, фаги, эубиотики;

• иммуноглобулины и иммунные сыворотки;

• иммуномодуляторы для иммунокоррекции: эндогенные (интер-лейкины, интерфероны, гормоны тимуса, миелопептиды и др.) и экзогенные (левамизол, адъюванты, циклоспорин, синтетич. и др.).

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Иммунный статус - это структурное и функциональное состояние иммунной системы человека, определяемое комплексом клинических и лабораторных иммунологических показателей. На состояние иммунной системы влияют возрастные, климатогеографические, социальные, экологические и многие другие факторы. "Биологические часы" иммунной системы - это тимус, инволюция которого с возрастом приводит к угасанию Т-клеточных реакций.

Иммунный статус можно объективно оценить путем постановки комплекса лабораторных тестов. Для оценки состояния доиммунных факторов неспецифической защиты определяют:

• фагоцитарные показатели;

• состояние системы белков комплемента;

• содержание белков острой фазы и цитокинов (интерферона, интерлейкина).

Для изучения лимфоцитарного иммунитета, в частности его гуморального звена, определяют:

1. Количество В-лимфоцитов в периферической крови и их бласттранс- формацию под действием поликлональных мутогенов (например, LPS).

2. Содержание иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови.

3. Титры специфических антител и катаболизм иммуноглобулинов.

Для оценки состояния клеточного звена специфического иммунитета определяют:

• количество Т-лимфоцитов и их субпопуляций в периферической крови;

• функциональную активность Т-клеток под действием Т-митогенов (р.бласттрансформации под действием конканавалина А и/или фи-тогемагглютинина);

• содержание гормонов тимуса;

• уровень секретируемых цитокинов;

• состояние ГЗТ с различными аллергенами.

В зависимости от результатов исследования все эти тесты выполняются в определенной последовательности, а поэтому подразделяются на 2 уровня.

Тесты 1-го уровня:

• определение количества и морфологии лимфоцитов периферической крови

• определение Т- и В-лимфоцитов по СД рецепторам или в реакции Е-РОК и ЕАС-РОК

• определение сывороточных Ig

• определение фагоцитарной активности лейкоцитов

• кожные тесты

• рентгенография, рентгеноскопия лимфоидных органов Эти тесты определяются в любой клинико-иммунологической лаборатории и достаточны для первичного выявления лиц с иммунопатологией.

Тесты 2-го уровня:

• гистохимический анализ лимфоидных органов

• анализ СО-маркеров различных субпопуляций лимфоцитов с использованием моноклональных антител

• бласттрансформация Т- и В-клеток

• определение цитотоксичности лимфоцитов

• определение активности ферментов, ассоциированных с ИД

• определение синтеза и секреции цитокинов

• определение гормонов тимуса

• анализ респираторного взрыва фагоцитов

• определение компонентов комплемента

• анализ смешанных клеточных культур лимфоцитов Иммунодефициты - это нарушения нормального иммунного статуса, обусловленные дефектом одного или нескольких механизмов иммунного ответа. В случае выявления отклонений от нормы показателей иммунного статуса назначают иммунокоррегирующую терапию.

Иммунобиологпческпе препараты:

Вакцины - препараты для иммунопрофилактики инфекционных заболеваний.

В качестве действующего начала в вакцинах используют:

•живые, ослабленные микроорганизмы (бактерии, вирусы);

• инактивированные микробные клетки;

• отдельные антигенные компоненты бактерий и вирусов (протективные антигены);

• вторичные, продуцируемые микробными клетками метаболиты, например токсины и их обезвреженные дериваты - анатоксины;

• полученные химическим синтезом молекулярные антигены микробов, вирусов;

• полученные генно-инженерным способом антигены микроорганизмов, вирусов.

Аттенуированные живые вакцины: содержат аттенуированные штаммы бактерий, вирусов (т.е. штаммы с пониженной вирулентностью, но сохранившие антигенные свойства). Их получают путем воздействия на патогенные штаммы неблагоприятных для микробов факторов: химических (ингибиторы роста), физических (температура, радиация), биологических (пассажи через организмы животных, культуры клеток, куриные эмбрионы). Примеры: туляремийная, сибиреязвенная, чумная, бруцеллезная, гриппозная, коревая, полиомиелитная, паротитная вакцины.

Дивергентные живые вакцины: созданы на основе природных штаммов микроорганизмов, имеющих общую антигенность с возбудителем. Примеры: оспенная вакцина (вирус коровьей оспы), ВСО (вакцина содержит возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота).

Живые рекомбинантные вакцины (векторные): при создании таких вакцин используют непатогенные микроорганизмы (кишечная палочка, вирус осповакцины, дрожжи), в геном которых встроены гены патогенных микробов, отвечающие за синтез протективных антигенов. Пример: дрожжевая вакцина против гепатита В.

Убитые вакцины содержат культуру бактерий или вирусов, убитых тем или иным способом (нагревание, действие УФ-лучей, ионизирующей, радиации, обработка формалином, спиртом, фенолом). В результате инактивации бактерии и вирусы теряют жизнеспособность, но сохраняют антигенные и иммуногенные свойства.

Корпускулярные вакцины состоят из инактивированных цельных клеток бактерий (цельноклеточные) или состоят из вирионов (цельновирионные). Примеры; цельноклеточные вакцины-коклюшная, холерная моновакцина, брюшнотифозная; цельновирионные - вакцины против гриппа, бешенства, клещевого энцефалита, герпеса. Субклеточные, субви-рионные, молекулярные вакцины состоят из отдельных структурных элементов микробов или вирусов, несущих специфические протективные антигены (субклеточные, субвирионные вакцины): менингококковая, гриппозные (Ваксигрипп, Гриппол). Для вирусных вакцин такого рода часто применяют термин «расщепленные вакцины».

В последние 20 лет в России ведутся работы по созданию принципиально новых вакцинирующих препаратов контролируемого содержания. В их основе определенные высокоочищенные антигены, в том числе синтетические или рекомбинантные аналоги протективных антигенов возбудителей. Приоритетность и оригинальность этих работ заключается в том, что одновременно для целевых антигенов создаются полимерные молекулы-носители, позволяющие значительно повысить иммунный ответу индивидуумов с генетически обусловленной слабовыраженной реактив­ностью.

Анатоксины - препараты, получаемые из экзотоксинов микробов, путем их обезвреживания (дифтерийный, столбнячный, стафилококковый). Следовательно, чтобы получить анатоксин необходимо: культивировать микроорганизмы на жидкой питательной среде, отделить микробные клетки от экзотоксинов методом фильтрования и добавить к фильтрату формальдегид 0,4%-ной концентрации для обезвреживания). Обезвреживание происходит при температуре 37°С - 40°С в течение 4 недель. При таком режиме полностью утрачивается токсичность, но сохраняются антигенные и иммуногенные свойства токсинов. Анатоксин подвергают очистке от балластных веществ. Анатоксины дозируют в антигенных или имуногенных единицах (ЕС-единицы связывания или Lf - единицы флокуляции). К очищенному анатоксину для усиления его иммуногенных свойств добавляют адъювант.

Адъюванты - (adjuvant - помощник) - это группа веществ, повышающих иммуногенные свойства вакцин и анатоксинов. В качестве адъювантов используют различные по природе и физико-химическим свойствам вещества: гель гидрата окиси или фосфата алюминия, липиды, эмульгаторы, полимерные соединения, полисахариды бактерий или сами убитые бактерии (полный адъювант Фрейнда - взвесь убитых микобактерий в минеральном масле), сапонины и др.