Экспериментальное заражение животных и бактериологическое исследование трупов

1. Студенты отрабатывают различные методы заражения лабораторных животных: накожный методы (кролик, морская свинка), внутрикожный метод, подкожный, внутривенный (вена уха кролика, ретро-орбитальное пространство у мышей), внутрибрюшинный метод. Знакомятся с правилами фиксации животных, осваивают правила асептики и антисептики.

2. Для обнаружения микроба, вызвавшего гибель животного, определения его локализации в организме производят вскрытие трупа мышки, зараженной накануне В.anthracoides.

3. Мышь фиксируют брюшком вверх на дощечку булавками за 4 лапки.

4. Шерсть животного протирается ватой, смоченной дезраствором или спиртом.

5. Делают срединный разрез кожи, осматривают брюшину, лимфоузлы

6. Вскрывают брюшную полость, макроскопически изучают органы

брюшной полости, отмечая их внешние изменения.

7. Готовят мазки-отпечатки из органов брюшной полости (селезенка, печень, почки) берут орган пинцетом, срезают кусочек ножницами и поверхностью среза прикасаются к предметному стеклу.

8. Вскрывают грудную полость, осматривают органы грудной полости, фиксируя их внешние изменения.

9. Готовят мазки-отпечатки из легочной ткани.

10. Стерильной пастеровской пипеткой после прижигания поверхности сердечной мышцы берут кровь из сердца и делают посев на сахарный бульон и готовят мазок на стекле.

11. Мазки - отпечатки, приготовленные на стекле, высушивают, фиксируют в жидком фиксаторе и окрашивают по Граму.

12. При микроскопии мазков необходимо обнаружить В. anthracoides и сделать заключение о форме инфекционного процесса и вирулентности возбудителя. Данные вскрытия заносятся в протокол.

Методы оценки функциональной активности фагоцитирующих клеток

Фагоцитоз с латексом

1. Кровь из пальца 0,1 мл с гепарином помещаем в центрифужную пробирку и добавляем 0,1 мл латекса (Латекс -10% полистерольная опалесцерующая суспензия с размером частиц 1,5 мкм). Пробирку инкубируют в термостате 37°С в течение 30 мин. Каждые 10 мин инкубации пробирку встряхивают.

2. Центрифугирование 5 мин. Надосадочная жидкость отбирается пипеткой, а из осадка делают мазок на предметном стекле, высушивают на воздухе, фиксируют этиловым спиртом и окрашивают по Романовскому-Гимзе.

3. Учет результатов: в иммерсионном микроскопе (увеличение 630) подсчитывают процент фагоцитирующих клеток- фагоцитарный показатель (вычисляют количество фагоцитирующих клеток на 100 лейкоцитов).

Далее определяют среднее количество поглощенных частиц латекса на 1 клетку (фагоцитарное число - фагоцитарный индекс).

У здоровых людей ФП - 40 - 80%, а ФЧ - 6 - 9 частиц на 1 фагоцит (при размере частиц латекса 1,5 мкм).

Фагоцитоз с культурой стафилококка

Реактивы - пирогенал (стимулятор фагоцитоза), гепарин, суточная культура стафилококка, краситель Романовского-Гимзе. Этапы опыта:

1. Кровь из пальца 0,2 мл помещают в первую пробирку с гепарином и во вторую пробирку, куда добавляют 0,1 мл пирогенала для стимуляции фагоцитоза (стимулированный фагоцитоз - ФС). В каждую из пробирок добавляют суточную культуру стафилококка в объеме 0,05 мл (стандарт мутности -1 млрд).

2. Инкубируют пробирки в термостате 30 мин, центрифугируют, отбирают надосадочную жидкость.

3. Из осадка делают мазок, высушивают, фиксируют этиловым спиртом, окрашивают по Романовскому-Гимзе.

4. Учет результатов при иммерсионной микроскопии (увеличение 630).

1 пробирка:

Спонтанный фагоцитоз - учет результатов через 30 мин. Определяется фагоцитарный показатель и фагоцитарный индекс.

Завершенный фагоцитоз-учет результатов через 120 мин. Определяется фагоцитарный показатель и фагоцитарный индекс.

Индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) определяется как отношение фагоцитарного индекса 30 мин к фагоцитарному индексу 120 мин (ИЗФ= ФИ 30 мин/ФИ 120 мин )

Если ИЗФ более 1, то это указывает на завершенный характер фагоцитоза.

Если ИЗФ менее 1, это указывает на незавершенный характер фагоцитоза.

2 пробирка:

Стимулированный фагоцитоз (в присутствии пирогенала). После инкубации и центрифугирования из осадка готовят мазки, которые высушивают, фиксируют и окрашивают аналогичным способом. В мазках подсчитывают фагоцитарный показатель, фагоцитарный индекс и индекс завершенности фагоцитоза через 120 мин.

Стимуляция пирогеналом может привести к завершенности фагоцитоза. Эти данные необходимо учитывать при коррекции иммунодефицитных состояний.