Методы культивирования облигатных внутриклеточных бактерий (риккетсий, хламидий) и вирусов
Для культивирования вирусов (так же, как и для других облигатных паразитов - риккетсий и хламидий) используют куриные эмбрионы, культуры тканей и лабораторных животных.
Куриный эмбрион - удобная модель для культивирования вирусов в целях получения вирусов и для приготовления диагностических, профилактических и лечебных препаратов - диагностикумов и вакцин. Куриные зародыши используют в возрасте от 8 до 12 дней, перед заражением инфекционным материалом скорлупу яйца над воздушной камерой обрабатывают 70% спиртом, обжигают, смазывают йодом (2% настойка), вторично протирают спиртом и обжигают. Вируссодержащий материал, обработанный для удаления бактериальной флоры, в асептических условиях наносят на хорион-аллантоисную оболочку или вводят в желточный мешок, аллантоисную полость, либо в амнион (ткань эмбриона). После заражения в аллантоисную полость через отверстие заливают парафин;
если материалом заражают хорион-аллантоис, отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, края которого замазывают парафином. После инфицирования эмбрионы помещают в термостат при 37°С. Признаки репродукции вируса проявляются особенно четко в месте заражения на хорион-аллантоисной оболочке в виде очагов поражения и геморрагий или для его обнаружения применяют специальные реакции (например, реакцию гемагглютинации - РГА).
Культуры клеток (тканей) получают из тканей животных и человека. Их делят на первичные, которые используют в течение одной генерации, и перевиваемые, которые поддерживают путем пассажей (перевивок) длительное время. Клетки перевиваемой культуры ткани готовят из нормальных (чаще эмбриональных) и злокачественных линий клеток, они способны сравнительно прочно прикрепляться к стеклу флакона, образовывать монослой клеток и многократно размножаться in vitro. Для поддержания жизнеспособности клеток применяются специальные синтетические среды (например, среда 199, среда Хэнкса), содержащие аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли с добавлением 5 -10% коровьей или лошадиной сыворотки. Трипсин используется при получении культуры клеток для дезагрегации тканей, т.е. для разобщения клеток. Репродукция вирусов в культуре клеток сопровождается так называемым цитопатическим действием (ЦПД), которое проявляется в изменении морфологии клеток и их гибели или образования синцития, а в некоторых случаях - в возникновении в инфицированных клетках клеточных включений. Характер и время проявления ЦПД зависит от вида вируса.
Для создания моделей вирусных инфекционных болезней и выделения вирусов используют лабораторных животных (белых мышей, хомяков, крыс, кроликов и др.). Чувствительность животных к вирусам зависит от вида животного и его возраста.
Культивирование риккетсий
Риккетсии являются облигатными паразитами, их культивирование возможно только в живых тканях. Обычно их выращивают в желточном мешке куриного эмбриона.
Культивирование хламидий
Хламидии можно размножать в желточном мешке куриного эмбриона или в культурах тканей позвоночных. Размножение в куриных эмбрионах происходит в температурных границах 33 - 41°С и даже более широких, но чувствительность к обеим крайним температурам и оптимум для роста варьирует от вида к виду.
Цели занятия:
1. Изучить принципы классификации питательных сред, методы выявления культуральных свойств бактерий на различных питательных средах и вирусов в различных условиях культивирования.
2. Освоить технику посевов бактерий на плотные и жидкие питательные среды.
3. Начать освоение методики выделения чистых культур аэробов.
Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Метаболизм микроорганизмов.
2. Источники углерода, азота, макро- и микроэлементов, ростовых факторов для микробов. Аутотрофы и гетеротрофы. Фототрофы и хемотрофы.
3.Питательные среды. Механизм переноса питательных веществ в бактериальную клетку
4. Определение понятий: культура, штамм, клон. Колонии, особенности их формирования у различных видов бактерий.
5.Принципы культивирования различных групп микроорганизмов.
Культуральные свойства бактерий.
6. Механизм и скорость размножения микроорганизмов. Фазы размножения микроорганизмов в жидкой питательной среде в стационарных условиях. Образование микробами пигментов, токсинов, витаминов, аминокислот, полисахаридов и других веществ.
7. Особенности роста и размножения риккетсий, хламидий и вирусов.
8. Методы культивирования бактерий, в том числе облигатных внутриклеточных: (риккетсий, хламидий) и вирусов.
Уметь:
1. Владеть техникой посева бактерий на жидкие и плотные питательные среды.
2. Описать культуральные свойства микроорганизмов.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Техника посева бактерий на питательные среды, выделение и идентификация чистых культур бактерий
Чистую культуру бактерий получают для проведения диагностических исследований - идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков микроорганизмов.
Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.
Культуральные свойства характеризуются питательными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плотных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по морфологии колоний и особенностям роста культуры.
Биохимические признаки бактерий определяются набором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической практике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах.
При идентификации бактерий до рода и вида обращают внимание на пигменты, окрашивающие колонии и питательную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marccescens, золотистый пигмент – Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент – Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка).
Для установления биовара (хемовара, серовара, фаговара) проводят дополнительные исследования по выявлению соответствующего маркера-определению фермента, антигена, чувствительности к фагам.
Посев уколом. Посев уколом в агар столбиком применяется для выращивания анаэробов или выявления характерного признака микроба, так как рост по уколу типичен для ряда бактерий. При посеве уколом в столбик желатины наблюдается разжижение ее бактериями, обладающими протеолитическим ферментом. Посев уколом в полужидкий агар практикуется также с целью длительного хранения культур.
При посеве уколом пробирку с агаром или столбиком желатины держат дном кверху, вынимают пробку и обжигают край пробирки. Материал, содержащий микробы, забирают обожженной на пламени платиновой иглой и прокалывают ею столбик питательной среды снизу вверх почти до самого дна пробирки
Посев петлей (посев штрихами). Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый материал петлей вносят в первый сектор и проводят ею параллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии.
Рис. 1. Схема рассева бактерий штрихами для получения изолированных колоний
