Стерилизации паром

Существует 2 режима стерилизации.

1. Стерилизация текучим паром в автоклаве или аппарате Коха при незавинченной крышке и открытом выпускном кране, когда антибактериальное действие пара проявляется в отношении вегетативных форм. Так стерилизуют среды с витаминами и углеводами, мочевиной, молоком, картофелем и желатиной. Для полного обеспложивания применяют дробную стерилизацию (при 100°С) 20-30 мин 3 дня.

2. Стерилизация паром под давлением в автоклаве - наиболее эффективный метод обеспложивания. При однократной обработке при 1-2 атм в течение 15-25 мин. погибают как вегетативные, так и споровые формы бактерий. Этим методом стерилизуют перевязочный материал, операционное белье, хирургические инструменты, лабораторную посуду, инфицированный материал, инъекционные растворы. Материал помещают в емкости (биксы). На дно бикса помещают прокладки из ткани, впитывающие влагу после стерилизации. Стерильность материала сохраняется 3 суток.

Паром под давлением стерилизуют также и питательные среды, кроме сред, содержащих нативные белки, жидкости, приборы, имеющие резиновые части. Простые среды (МПА, МПБ) стерилизуют 20 мин при 120°С (1 атм). Среды, содержащие нативные белки и углеводы, при этой температуре нельзя стерилизовать, т. к. это легко изменяющиеся от нагревания вещества. Среды с углеводами стерилизуют дробно при 100°С или при 112°С (0,5 атм) 10-15 мин. Различные жидкости, приборы, имеющие резиновые шланги, пробки, бактериальные свечи и фильтры стерилизуют при 120°С(1 атм) в течение 20 мин.

Контроль стерилизации

Для контроля используют различные тесты, представляющие чаще всего порошкообразные вещества, меняющие консистенцию или цвет при достижении определенной температуры стерилизуемого материала (бензойная кислота 121°С, антипирин - 113°С, резорцин - 110°С). В настоящее время используются бумажные индикаторы стерилизации одноразового применения для контроля параметров режимов работы паровых и воз­душных стерилизаторов. Бумажные полоски закладываются в разных местах со стерилизуемым материалом и после окончания цикла сверяют изменение окраски индикатора с эталоном. Если индикатор светлее эта­лона, стерилизуемые объекты подлежат повторной стерилизации.

Для экспресс-контроля концентраций рабочих растворов для дезинфекции также используются индикаторные полоски (Дезаконт-ПВ-01).

Цели занятия:

1. Изучить сущность дыхания бактерий, классифицировать микробы по типу дыхания.

2. Освоить методику посевов и выделения чистых культур аэробов и анаэробов.

3. Изучить характер влияния на микроорганизмы физических и хими­ческих факторов.

4. Освоить методы стерилизации и принцип работы автоклава и сухо-жаровогр шкафа.

Учебно-целевые задачи:

Знать:

1. Сущность дыхания бактерий. Классификация микробов по типу дыхания.

2. Аэробный и анаэробный типы биологического окисления.

3. Принципы культивирования анаэробных бактерий.

4. Этапы выделения чистых культур микроорганизмов, их идентификация.

5. Действие на микроорганизмы физических и химических факторов. Стерилизация и дезинфекция. Асептика и антисептика.

Уметь:

1. Готовить посуду к стерилизации в сухожаровом шкафу и автоклаве.

2. Описать культуральные свойства бактерий.

3. Освоить методику создания анаэробных условий.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Просматривая извлеченные из термостата чашки с пластинчатым агаром, засеянные в первый день исследования, обращают внимание на наличие колоний разных типов по форме, цвету величине, консистенции. Каждому виду микроба свойственен определенный характер колоний. Это помогает выбрать колонию искомого микроба и поставить диагноз заболевания. Снимают изолированную колонию петлей и пересевают на скошенный агар, а из остатка пересеянной колонии готовят микропрепарат и исследуют его, окрасив по Граму После инкубации посева в термостате на скошенном агаре вырастает чистая культура микроба.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

1. Бригада студентов учитывает пересевы бактериальных культур.

2. Каждый студент изучает и подробно описывает различные типы колоний, выросшие на чашках. Отсевает одну из колоний на скошенный агар, а из остатка бактерий на петле делает мазок, окрашивает по Граму и микроскопирует. Результаты записывают в протокол.

ДЕМОНСТРАЦИИ

1. Колонии на пластинчатом агаре в чашках Петри. Отсев одной колонии на скошенный агар.

2. Рассмотрение различных методов культивирования анаэробов: анаэростат, посев по Фортнеру посев на среду Китт-Тароцци, столбик среды Вильсона-Блера, использование газ-пакета.

3. Демонстрация аппаратуры для стерилизации: автоклавы, сухожаровые шкафы, электрический стерилизатор, фарфоровые свечи и фильтры Зейтца. Термостат и терморегуляторы, свертыватель Коха. Тесты контроля стерилизации.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Что называется стерилизацией?

2. Что такое дезинфекция?

3. Что такое асептика и антисептика? '

4. Что такое пастеризация?

5. Каковы условия стерилизации в автоклаве?

6. Каковы условия стерилизации в сухожаровых печах Пастера?

7. Какие тесты контроля стерилизации вы знаете?

8. Что такое дробная стерилизация и в каких случаях к ней прибегают?

9. Почему в отдельных случаях при пересеве одной колонии получаем рост смеси бактерий?

10. Какие свойства необходимо учитывать при изучении колоний?

11. Как характеризуется рост бактерий на жидких и полужидких

питательных средах?

12. В чем сущность аэробного типа окисления?

13. В чем сущность анаэробного типа окисления?

14. Какие среды применяют для культивирования анаэробов?

15. Какие существуют методы культивирования анаэробов?

16. Какой способ чаще всего применяется для стерилизации стеклянной лабораторной посуды?

17. Как стерилизуются дифференциально-диагностические среды, содержащие углеводы?

18. Как стерилизуют сывороточные питательные среды?

19. Как стерилизуют Простые питательные среды?

20. Какие существуют методы выращивания облигатных анаэробов?

21. Какие бактерии называют микроаэрофилами?

22. Какие бактерии называют психрофилами, мезофилами, термофилами?

ЗАНЯТИЕ №7

Темы:

• Методы выделения и идентификация чистых культур аэробных бактерий (продолжение): биохимическая активность бактерий.

• Антибиотики.

План занятия:

1. Идентификация выделенной чистой культуры по биохимическим свойствам.

2. Антагонизм микроорганизмов.

3. Классификации антибиотиков.

4. Механизмы антимикробного действия важнейших групп антибиотиков.

5. Методы определения антибиотиков в жидкостях организма.

6. Количественное и качественное определение чувствительности бактерий к антибиотикам.

7. Механизмы развития антибиотикорезистентности бактерий и пути ее преодоления.

8. Осложнения при лечении антибиотиками.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

А. Идентификация выделенной на скошенном агаре культуры бактерий проводится после установления чистоты (однородности) культуры по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам. Определяют ферментативные (биохимические) свойства микробов, фаго - и колициночувствительность, токсигенность и другие признаки, характеризующие их видовую принадлежность. В некоторых случаях у выделенных бактерий определяют также эпидемиологические маркеры (серовар, фаготип, биовар, колициновар), с помощью которых можно установить очаги инфекции и пути ее распространения.

Б. В естественных условиях микроорганизмы существуют в сложных ассоциациях, внутри которых складываются разнообразные взаимоотношения, определяющиеся, в первую очередь, физиолого-биохимическими особенностями членов ассоциаций, а также различного рода экологическими факторами. Взаимоотношения между микроорганизмами могут быть симбиотические (симбиоз, метабиоз, сателлитизм, синергизм) и конкурентные (антагонизм, паразитизм, хищничество).

Симбиоз - взаимоотношения микроорганизмов, при которых два или более вида микроорганизмов при совместном развитии создают для себя взаимовыгодные условия. Типичный пример таких взаимоотношений - совместное развитие аэробных и анаэробных бактерий. В кефирных зернах одновременно развиваются молочнокислые бактерии и дрожжи, при этом молочнокислые бактерии, испытывающие потребность в витаминах, получают их в результате развития дрожжей, последние получают благоприятные условия для развития за счет подкисления среды. При метабиозе продукты жизнедеятельности одного микроорганизма, содержащие значительное количество энергии, потребляются другими микроорганизмами в качестве питательного материала. Между ними складываются синтрофные связи, при которых субстрат используется одновременно несколькими видами микробов. В частности, некоторые инфекционные заболевания человека являются полимикробными, т. е. вызываются синтрофными ассоциациями бактерий. Газовая гангрена, например, обусловлена действием нескольких возбудителей из рода Clostridium в ассоциации с различными аэробными бактериями, главным образом стафилококками и стрептококками.

Разновидностью метабиоза является сателлитизм, для которого характерно, что одни микроорганизмы выделяют в среду ростовые вещества (аминокислоты, витамины и др.), стимулирующие развитие другого микроорганизма или макроорганизма - хозяина, как например нормальная микрофлора у человека. При синергизме у членов микробной ассоциации взаимно повышается физиологическая активность за счет выделения продуктов, стимулирующих их развитие.

Помимо благоприятных взаимоотношений между микроорганизмами наблюдаются и такие, при которых один вид микроорганизмов полностью или частично подавляет рост и развитие других видов, т. е между ними при их развитии наблюдается антагонизм. Причины, приводящие к антагонизму, разнообразны:

1. Антагонизм, складывающийся при совместном развитии разных видов, нуждающихся в одних и тех же питательных веществах. В этом случае преимущества будут у того микроорганизма, скорость роста которого выше скорости роста других. Так, при совместном высеве на питательный субстрат, необходимый одновременно для роста и эубактерий и актиномицетов, эубактерии будут развиваться быстрее.

2. Антагонизм, связанный с образованием микроорганизмами органических кислот, спиртов, или других продуктов обмена, которые изменяют условия среды, делая ее непригодной для развития других микроорганизмов. В процессе смены микрофлоры свежего молока в нем содержатся как молочнокислые, так и гнилостные бактерии. Вначале они развиваются одинаково, но в результате размножения молочнокислых бактерий накапливается молочная кислота и молоко значительно подкисляется. В этих условиях наблюдается подавление роста, а затем и полная гибель гнилостных бактерий.

3. Антагонизм, связанный с образованием и выделением в окружающую среду антибиотических веществ (антибиотиков, бактериоцинов и др.).

Процесс хищничества состоит в том, что некоторые микроорганизмы разрушают клетки других видов микроорганизмов и используют их в качестве питательного субстрата. К числу микроорганизмов-хищников относят главным образом миксоформы (миксобактерии, миксомицеты).

Паразитизм характеризуется тем, что один вид микроорганизмов (паразит) поселяется в клетках другого (хозяина) и питается за его счет. Облигатные паразиты не могут развиваться в отсутствии хозяина. К типичным паразитам относятся бактериофаги.

Наиболее существенной формой конкурентных взаимоотношений, имеющей важное практическое использование, является образование микробами-продуцентами специфических продуктов обмена, угнетающих или полностью подавляющих развитие микроорганизмов других видов.

Практическое значение антагонизма для медицины: 1) применение бактериальных препаратов, содержащих живые антагонистически действующие микроорганизмы, для угнетения патогенных и условно-патогенных микробов и лечения нарушений нормального микробиоценоза кишечника (дисбактериоза) - колибактерин, бифидумбактерин, лактобактерин и др.; 2) использование микробов-антагонистов для производства антибиотиков.

Антибиотики - вещества, образуемые различными живыми клеточными структурами, способные подавлять рост и вызывать гибель определенных микроорганизмов. По происхождению антибиотики подразделяют на следующие группы:

•Антибиотики, образуемые бактериями (грамицидин, полимиксин и др.);

•Антибиотики, образуемые актиномицетами (линкомицин и др.);

• Антибиотики, образуемые грибами (пенициллин, цефалоспорины и др.);

•Антибиотики, образуемые растениями (фитонциды: аллицин, рафанинидр.);

• Антибиотики, образуемые животными клетками (экмолин, эритрин);

• Синтетические и полусинтетические антибиотики.

По химическому составу антибиотики относятся к следующим основным группам:

• Азотсодержащие гетероциклические соединения, имеющие в своем составе бэта-лактамовое кольцо (пенициллины);

• Ароматические соединения (левомецитин);

• Тетрациклины, содержащие четыре конденсированных шестичленных цикла (тетрациклины и др.);

• Аминогликозидные соединения, в составе которых имеются аминосахара (стрептомицин и др.);

• Макролиды: содержат макроциклическое кольцо, связанное с аминосахарами (эритромицин и др.);

• Ациклические (полиеновые) соединения с несколькими двойными связями - /СН=СН/ (нистатин и др.);

• (Фтор) хинолоны.

По антимикробному спектру антибиотики подразделяют на две группы: узкого и широкого спектра действия. Антибиотики узкого спектра действуют на определенные группы бактерий (например, пенициллин, оказывающий губительное действие только на шаровидные бактерии, спирохеты и некоторые грамположительные бактерии). Антибиотиками широкого спектра действия являются аминогликозиды, подавляющие рост кислотоустойчивых, многих грамположительных и грамотрицательных бактерий, простейших, риккетсий, хламидий.

Антибактериальное действие антибиотиков измеряют в единицах действия (Е.Д.), содержащихся в 1 мл раствора препарата или в 1 мг химически чистого вещества. За единицу активности принимается то минимальное количество антибиотика, которое задерживает рост стандартного штамма определенного вида микроорганизма в строго определенных условиях.

Механизм антибактериального действия антибиотиков различен. У одних он связан с нарушением или блокированием синтеза клеточной стенки (пенициллины, цефалоспорины). У других - с адсорбцией на ЦПМ и взаимодействием с ее стерольным компонентом, что приводит к быстрой потере клеткой низкомолекулярных водорастворимых веществ цитоплазмы или нарушением жизненно важных функций ЦПМ (нистатин, полимиксины). У третьих - в блокировании синтеза белка рибосомами бактерий и нарушении считывания генетического кода, что нарушает репликацию бактерий (стрептомицин). Антибиотики, обладающие противоопухолевым действием, избирательно подавляют синтез нуклеиновых кислот в клетках злокачественных опухолей, для которых характерен дефект репарационных механизмов, в связи с чем они не в состоянии восстанавливать поврежденную ДНК.

Цели занятия:

1. Изучить сущность и механизм действия различных ферментных систем у бактерий; освоить методику их изучения и применения для идентификации чистых культур.

2. Изучить особенности взаимоотношений между микроорганизмами как основу учения об антибиотизме и антибиотиках.

3. Освоить методы определения антибиотикочувствительности бактерий.

Учебно-целевые задачи:

Знать:

1. Классификация ферментов бактерий, механизмы их действия, методы изучения.

2. Этапы выделения чистых культур микроорганизмов, их идентификация по биохимическим свойствам.

3. Химиотерапия. Понятие о химиотерапевтическом индексе. Принципы атимикробной химиотерапии.

4. Симбиотические и конкурентные взаимоотношения между микроорганизмами.

5. Микробный антагонизм, его механизмы. Микроорганизмы - продуценты антибиотиков.

6. Классификация антибиотиков по химическому строению, происхождению, механизму и спектру антимикробного действия, способам получения.

7. Методы определения антибиотикочувствительности бактерий.

8. Побочное действие антибиотиков на организм человека.

Уметь:

1. Интерпретировать результаты изучения ферментативной активности бактерий и их антибиотикограммы.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Устойчивость ферментных систем бактерий позволяет использовать биохимические свойства бактерий в сочетании с их морфологическими, культуральными и другими признаками для идентификации бактерий и установления микробиологического диагноза. Для определения биохимических свойств исследуемую культуру микробов засевают на специальные дифференциально-диагностические среды, которые в зависимости от состава и своего на­значения можно разделить на 4 группы:

• среды, содержащие белковые вещества (желатину, молоко, свернутую сыворотку крови, куриный белок и т.д.) для выявления протеолитических ферментов;

• среды с сахарами или многоатомными спиртами для определения сахаролитической активности;

• среды с химическими веществами, изменяющимися под влиянием

окислительно-восстановительных ферментов, продуцируемых микробами;

• среды, содержащие индифферентные химические вещества, являющиеся источником питания одних видов и не ассимилируемые другими видами микробов.

В состав дифференциально-диагностической среды обычно входит индикатор, указывающий на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента.

Сахаролитические свойства, т.е. способность расщеплять сахар и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа изучают на средах Гисса, которые содержат тот или иной углевод и индикатор. При ферментации бактериями углеводов с образованием кислоты и альдегидов цвет среды меняется за счет находящегося в ней индикатора, что создает впечатление пестроты - «пестрый ряд». В зависимости от изучаемого рода и вида бактерий подбирают среды с соответствующими моно- и дисахаридами (глюкоза, лактоза и др.), полисахаридами (крахмал, гликоген и др.), высшими спиртами (глицерин, маннит и др.), в процессе ферментации которых образуются альдегиды, кислоты и газооб­разные продукты /С02, H2, СН4/, последние накапливаются в «поплавке».

Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, Левина, Плоскирева. Микроорганизмы, сбраживая до кислоты находящийся в этой среде молочный сахар, образуют окрашенные колонии (кислота изменяет цвет индикатора). Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны.

Молоко при росте микробов, сбраживающих лактозу, свертывается. При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщепление. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя (цвет среды не изме­няется). Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

Среда Вильсона-Блера. Готовят из мясо-петонного агара, к которому добавляют глюкозу, Na2SO3, хлористое железо FeCl2. На этой среде возбудитель газовой гангрены образует почернение и разрыв агара. При этом в анаэробных условиях осуществляется восстановление сернокислого натрия до сернистого, последний же вступает в реакцию с хлорным железом, переводя его в сернистое железо, имеющее черный цвет.

Протеолитические ферменты у бактерий изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой и пептоном. При посеве уколом в желатин некоторые микробы (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и др.) при комнатной температуре (20-22°С) разжижают его, при­чем различные виды микробов дают характерную для него форму разжижения (послойно в виде гвоздя, елочки и т.д.). При посеве на свер­нутую сыворотку вокруг колоний появляются углубления (разжижение). В молоке происходит расщепление сгустка казеина с образованием пептона, в результате чего оно приобретает желтоватый цвет.

Показателями более глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода. Для обнаружения индола по способу Мореля узкие полоски фильтровальной бумаги смачивают горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушивают. Индикаторную бумажку помещают между стенкой пробирки с МПА и пробкой. При выделении индола на 2-3-й день нижняя часть полоски бумаги приобретает розовый цвет. Другой, более чувствительный, метод позволяет концентрировать индол на поверхности среды ксилолом или эфиром, а добавление раствора Ковача (парадиметиламинобензальдегида) дает образование красного кольца. Индол образуется при наличии у бактерий фермента триптофаназы.

Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца, которую закрепляют между стенкой засеянной пробирки и пробкой. При взаимодействии сероводорода и ацетата свинца бумага чернеет в результате образования сульфида свинца.

Наличие аммиака определяют по посинению розовой лакмусовой бумажки, помещенной между стенкой и пробкой засеянной пробирки.

Наличие уреазы определяют на среде с мочевиной и индикатором фенолротом (начальный цвет среды-желтый). При расщеплении мочевины на аммиак и углекислый газ накапливается аммоний, что сдвигает рН в щелочную сторону и изменяет цвет индикатора в красный.

Определение образования ацетона проводится с помощью реакции Фогес-Проскауэра. Добавление к культуре 40% КОН и 5% альфа-нафтола дает красное окрашивание, т.е. в щелочных условиях ацетон образует с альфа-нафтолом соединение красного цвета - ацетилметилкарбинол.

Утилизацию цитрата в целях выявления способности бактерий использовать его как источник углерода проверяют на среде Симонса. Среда содержит набор солей, агар, неорганический источник азота, цитрат натрия, индикатор бромтимоловый синий. При наличии фермента цитратпермеазы среда подщелачивается и окрашивается в синий цвет. При отсутствии роста бактерий среда остается зеленой.

Система индикаторных бумажек (СИБ) позволяет выявлять самые разнообразные ферменты бактерий. Бумажки пропитаны индикатором, углеводами, аминокислотами, цитратом, ацетатом, малонатом и др. веществами. Утилизация вещества приводит к изменению рН среды, изме­нению цвета индикатора. Имеются наборы, которые содержат от десяти до тридцати тест-бумажек. Посев испытуемой культуры производится в стерильный физиологический раствор (в некоторых случаях в забуференный: рН 5,4-5,6).

Наличие каталазы у аэробов и факультативных анаэробов выявляется внесением петли культуры бактерий в каплю 3% перекиси водорода. При этом выделяются пузырьки O2. У облигатных анаэробов каталаза отсутствует, и перекись водорода оказывает на них губительное действие.

Обнаружение цитохромоксидазы у аэробов проводится путем нанесения и растирания петли культуры на индикаторную бумажку, пропитанную спиртовым раствором альфа-нафтола и 1% водным раствором ментола. Бумажка синеет.

Выявление нитратредуктазы характерно в основном для факультативных анаэробов. Фермент восстанавливает нитраты в нитриты. Нитрат является конечным акцептором электронов. В кислой среде нитраты окисляют иодид калия. Выделившийся йод, реагируя с крахмалом, дает синее окрашивание среды. Тип окисления глюкозы в аэробных или анаэробных условиях устанавливается на среде Хью-Лейфсона. В среде содержится агар, соли, пептон, глюкоза и индикатор бромтимоловый си­ний. Для создания анаэробных условий среда заливается слоем вазелинового масла. Посев выращивают 3-4 суток. Образование кислоты из глюкозы изменяет зеленый цвет среды в желтый. Утилизация глюкозы в аэробных и анаэробных условиях свидетельствует о преобладании бродильных процессов. Аэробы (Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa) расщепляют глюкозу в аэробных условиях, анаэробы - только в анаэробных. Факультативные анаэробы (Escherichia coli) утилизирует глюкозу в аэробных и анаэробных условиях.

Гемолитические свойства микроорганизмов изучают при посеве их на среды с кровью. Жидкие среды при разрушении эритроцитов становятся прозрачными, а на плотных средах вокруг колоний появляется прозрачная зона.