5. Рост и размножение бактерий

Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом — форми­рованием структурно-функциональных компонентов клетки иб

Р

а

ис. 3.1. Ультратонкие срезы делящихся бактерий. Электронограмма.

а — врастание перегородки деления у стафилококка, б — образование перетяжки у кишечной палочки (указано стрелками).

увеличением самой бактериальной клетки и размножением — самовоспроизведением, приводящим к увеличению количества бактериальных клеток в популяции.

Бактерии размножаются бинарным делением пополам, реже почкованием. Актиномицеты, как и грибы, могут размножаться' спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются также путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтези­рующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрица­тельные — путем перетяжки в результате образования гантеле­видных фигур из которых затем образуются две одинаковые клетки (рис.3.1).

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хро­мосомы по полуконсервативному типу: двунитевая цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной нитью. Это приводит к удвоению молекул ДНК бактериального ядра - нуклеоида. Репликация хромосомной ДНК осуществля­ется от начальной точки on (от англ. origin — начало). Хромосома бактериальной клетки связана в области ori с цитоплазматичес­кой мембраной. Репликация ДНК катализируется ДНК полиме­разами. Сначала происходит раскручивание (деспирализация) двойной цепи (нити) ДНК, в результате чего образуется реп­ликативная вилка (разветвленные цепи): одна из цепей, дост­раиваясь, связывает нуклеотиды от 5'- к З'-концу, другая до­страивается посегментно.

Репликация ДНК осуществляется в 3 этапа: инициация, элон­гация (рост цепи) и терминация. Образовавшиеся в результате репликации две хромосомы расходятся, чему способствует уве­личение размеров растущей клетки: прикрепленные к цитоплаз­матической мембране или ее производным (например, мезосо-

Рис. 3.2. Фазы размножения бактерий.

мам) хромосомы по мере увеличения объема клетки удаляются друг от друга. Окончательное их обособление завершается обра­зованием перетяжки (или перегородки) деления. Клетки с перегородкой деления расходятся в результате действия аутоли- тических ферментов, разрушающих сердцевину перегородки. Аутолиз при этом может происходить неравномерно: делящиеся клетки на одном участке остаются связанными частью клеточ­ной стенки в области перегородки деления. Такие клетки рас­полагаются под углом друг к другу, что характерно для диф­терийных коринебактерий.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, но не изменяющийся объем жидкой питательной среды, размножаясь, потребляют питатетьные эле­менты, что в дальнейшем приводит к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий. Культивирование бакте­рий в такой системе называют периодическим, а культуру — периодической. Если же условия культивирования поддерживают­ся путем непрерывной подачи свежей питательной среды и от­тока такого же объема культуральной жидкости, то такое куль­тивирование называется непрерывным, а культура — непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры.

Рост периодической культуры бактерий подразделя­ют на несколько фаз, или периодов: 1) лаг-фаза;

2. фаза логарифмического роста; 3) фаза стационар­ного роста, или максимальной концентрации бакте­рий; 4) фаза гибели бактерий.

Эти фазы можно изобразить графически в виде отрезков кри­вой размножения бактерий, отражающей зависимость логариф­ма числа живых клеток от времени их культивирования (рис.3.2).Лаг-фаза (от англ. lag — запаздывание) — период между по­севом бактерий и началом их размножения. Продолжительность лаг фазы составляет в среднем 4—5 ч. Бактерии при этом уве­личиваются в размерах и готовятся к делению, повышается количество нуклеиновых кислот, белка и других компонентов клетки. Фаза логарифмического (экспоненциального) роста явля­ется периодом интенсивного деления бактерий продолжительно­стью около 5—6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20—40 мин (время генерации — интер­вал между делениями клетки). Во время этой фазы бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувствительностью интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др. Затем наступает фаза стационарного роста, при которой количество жизнеспособных клеток остает­ся без изменений, составляя максимальный уровень (М-кон- центрация). Ее продолжительность выражается в часах и колеб­лется в зависимости от вида бактерий, особенностей их куль­тивирования. Рост бактерий завершается фазой гибели, характе­ризующейся отмиранием клеток в условиях истощения источ­ников питательной среды и накопления в ней продуктов ме­таболизма бактерий. Продолжительность этой фазы колеблется от десятков часов до нескольких недель. Интенсивность роста и размножения бактерий зависит от многих факторов, в том числе от оптимального состава питательной среды, окислительно-вос­становительного потенциала, pH, температуры и др.

Если к бактериям постоянно добавлять питательную среду и одновременно удалять продукты обмена, можно поддерживать бактериальную культуру в логарифмической фазе роста. Для этого применяют хемостат.

Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бакте­рии, растущие на плотных питательных средах, образуют изо­лированные колонии округлой формы с ровными или неров­ными краями различной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий.

Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питатель­ную среду и окрашивают ее, например синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) окрашивает среду в синий цвет. Другая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в орга­нических растворителях. Так колонии «чудесной палочки» имеют кроваво- красный пигмент, растворимый в спирте. И, наконец, существуют пигменты, нерастворимые ни в воде, ни в органи­ческих соединениях.

Наиболее распространены среди бактерий такие пигменты, как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины являются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красно­го цвета, они синтезируются из фенольных соединений. Мела­нины наряду с каталазой, супероксиддисмутазой и пероксида- зой защищают микробы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают антимикроб­ным, антибиотикоподобным действием.

Вид, форму, цвет и другие особенности колоний на плотной питательной среде (культуральные свойства) учитывают при идентификации бактерий, а также отборе колоний для получе­ния чистых культур.

В промышленных условиях при получении биомассы микро­организмов с целью приготовления антибиотиков, вакцин, диагностических препаратов и эубиотиков культивирование в основном осуществляют в ферментерах при строгом соблюдении оптимальных параметров для роста и размножения культур (см. главу 6).

3. 1.6. Культивирование бактерий

Бактерии выращивают на естественных и искусственных пита­тельных средах. Естественные среды (молоко, сусло-агар, сиро­пы и др.) имеют несбалансированное соотношение компонен­тов, их состав полностью не изучен. Искусственные питатель­ные среды включают вещества в строго определенных соотно­шениях с учетом потребностей данного вида в питательных веществах, ростовых добавках, солях и т.п.

Питательные среды должны быть стерильными и иметь, помимо необходимых для роста бактерий компонентов, опти­мальные значения pH, окислительно-восстановительного потен­циала, осмотического давления и т.д. Среды различаются в зависимости от консистенции, состава и назначения: по кон­систенции — плотные, полужидкие и жидкие; по составу — простые, сложные органические и синтетические (искусствен­ные); по назначению — специальные, элективные и дифферен­циально-диагностические.

Основой плотной питательной среды являются гелеобразные вещества: агар-агар (2—3 %), желатин (10—15 %) и др. Эти компоненты добавляют к жидким питательным средам, напри­мер, к мясопептонному бульону (МПБ), получая таким образом мясопептонный агар (МПА). Эти простые питательные среды применяют для выращивания многих бактерий. Сложные пита­тельные среды включают дополнительные компоненты — сы­воротку крови (сывороточный агар), кровь (кровяной агар), сахар (сахарный бульон) и т.д. Их используют для выявления свойств бактерий, т.е. это специальные питательные среды. Например, на кровяном агаре бактерии, продуцирующие гемолизин, обра- зуют колонии с зоной гемолиза.

Определенные виды бактерий выделяют, используя электив­ные (избирательные) среды. Например, элективной средой для стафилококков является желточно-солевой агар (ЖСА), для холерного вибриона — щелочный МПА, для дифтерийной палочки — свернутая сыворотка

Для выделения некоторых бактерий, рост которых может подавляться сопутствующими микробами, используют среды обогащения. Так, для выделения сальмонелл и шигелл из фе­калий применяют селенитовый бульон, подавляющий рост сопутствующей микрофлоры — кишечной палочки.

Дифференциально-диагностические среды (Гисса, Эндо, Левина, Плоскирева и др.) предназначаются для дифференци­рования бактерий. Они содержат индикатор, меняющий свой цвет при изменении pH в результате расщепления ферментами углеводов питательных сред.

Имеются питательные среды, сочетающие свойства диффе­ренциально-диагностических и других питательных сред. Так, с помощью среды Плоскирева (как и среды Эндо) можно отли­чить кишечную палочку от дизентерийной по их действию на лактозу. Кишечная палочка, расщепляя лактозу с кислотообра- зованием, при росте дает колонии красного цвета (цвет инди­катора) в отличие от дизентерийной палочки, не расщепляю­щей лактозу. Наличие же в среде Плоскирева солей желчных кислот способствует преимущественному росту дизентерийной палочки, а бриллиантового зеленого — ведет к подавлению сопутствующих грамположительных бактерий.

Большинство патогенных и условно-патогенных бактерий растет в термостате при температуре 37 °С. Рост на питательных средах обычно учитывают через сутки после посева. Рост неко­торых возбудителей (туберкулеза, бруцеллеза) становится види­мым через 15—30 дней. Скорость роста бактерий зависит от их биологических свойств и условий культивирования (температу­ра, наличие или отсутствие кислорода, углекислого газа, дав­ление и др.). Аэрация способствует ускоренному росту аэробов С этой целью используют шюттель-аппараты (<встряхиватели»). Для культивирования анаэробов применяют специальные пита­тельные среды (среда Китта—Тароцци, тиогликолевая среда, связывающие кислород), которые перед посевом кипятят для удаления растворенного кислорода

Применяют также физические, химические и биологичес­кие методы культивирования анаэробов. Физический метод зак­лючается в удалении из аппарата или эксикатора воздуха и замене его газовой бескислородной смесью. Химический метод основан на применении химических поглотителей кислорода. Биологический метод Фортнера предусматривает одновремен­ный посев на одну половину чашки Петри аэробных и на другую половину — анаэробных бактерий, после чего чашку с посевом герметизируют парафином. При этом аэробы, исполь­зуя при своем росте кислород, создают условия для дальней­шего роста анаэробов.

Выросшие на питательных средах бактерии идентифицируют по типу колоний на твердых питательных средах и характеру роста на жидких питательных средах. На жидких средах бактерии образуют пленку на поверхности среды, наблюдается придон­ный рост или равномерное помутнение среды.

Принципы промышленного культивирования бактерий изло­жены в главе 6.

7. Особенности культивирования риккетсии и хламидий

Риккетсии и хламидии — грамотрицательные мелкие бактерии, являющиеся, как и вирусы, облигатными внутриклеточными паразитами; размножаются в цитоплазме и ядре инфицирован­ных клеток. Они не растут на искусственных питательных сре­дах, используемых для культивирования обычных бактерий.

Для культивирования риккетсий и хламидий применяют куриные эмбрионы, культуры клеток с пониженным метабо­лизмом, а также чувствительных животных Риккетсии можно культивировать путем инфицирования ими переносчиков воз­будителей инфекций — вшей, блох, клещей.

7. Выделение чистых культур бактерий

Объекты окружающей среды, включая и материал от больного (гной, мокрота, фекалии и др.), обычно содержат смесь раз­личных микробов. С целью их обнаружения и определения видовой принадлежности (идентификация) применяют бактериологичес­кое исследование (бактериологический метод), которое заключа­ется в посеве проб исследуемого материала на питательные среды для получения (выделения) чистой культуры.

Для выделения чистой культуры, которое производят по­этапно в течение нескольких дней, в начале его используют механическое разобщение бактерий на плотных питательных средах (посев штрихом, шпателем на несколько чашек Петри и др.). На следующий день получают отдельные изолированные колонии. Колония — скопление бактерий, ведущее начало от одной клет­ки, а поэтому представляющее собой чистую культуру.

После описания культуральных свойств различных типов колоний (размер, цвет, форма, края и др.), выросших на чашке с плотной питательной средой, делают пересев из каждого типа колоний на скошенный агар для накопления чистой культуры. Выросшую на 3-й день чистую культуру (после проверки ее чистоты путем микроскопирования) начинают идентифициро­вать по различным свойствам — морфологическим, тинктори- альным, ферментативным, антигенным и др

Существуют способы выделения чистых культур, основанные на обработке исследуемого материала с помощью физических или химических факторов, обладающих избирательным действием на определенные бактерии. Для выделения чистых культур исполь­зуют также способность некоторых бактерий быстро размножать­ся в организме восприимчивых к ним лабораторных животных.

При выделении чистых культур анаэробов посевы исследуе­мого материала производят в анаэробных условиях на специаль­ные среды с пониженным редокс-потенциалом, а также исполь­зуют специальные аппараты (например, анаэростаты), исключа­ющие доступ свободного кислорода к растущей культуре.