II этап

Учет результатов посева по культуральным признакам

Предварительный ответ

Характер колоний

Мазок, окраска по методу Грама

Гемолиз

III этап

Пересев типичных колоний на скошенный агар (получение чистой культуры)

Идентификация чистой культуры

Определение чувствительности к антибиотикам

Серологическая идентификация и серотипирование (определение серогруппы)

4.3. .Коринебактерии

Род Corynebacterium семейства Corynebacteriaceae. Большинство видов, принадлежащих к роду,являются патогенными и условно-патогенными микроорганизмами.

Возбудитель дифтерии - Corynebacterium diptheriae

Эпидемиология. Резервуар инфекции — больной человек, реконвалесцент, бактерионоситель. Основной путь передачи — воздушно-капельный, возможно заражение через предметы, используемые больным, иинфицированные пищевые продукты (обычно молоко). На игрушках сохраняется до 2 нед, в пыли — до 5 нед, в воде и молоке — до 6-20 сут, на рассеянном свету остаётся жизнеспособным до 8ч. Дезинфектанты и антисептики инактивируют бактерии в течение 5-10 мин. Пик заболеваемости приходится на осенне-зимние месяцы.

Морфология

Дифтерийная палочка представлена тонкими, слегка изогнутыми или прямыми палочками размером 1-12x0,3-0,8 мкм, образуют неподвижные прямые или слегка изогнутые палочки, окружённые микрокапсулой, не образуют спор. Часто они утолщены на концах и напоминают булаву [от греч. согупе, булава], характерен выраженный полиморфизм – встречаются кокковидные, толстые колбовидным утолщением на концах, нитевидные, ветвящиеся и другие формы. На поверхности бактерий имеются фимбрии, облегчающие адгезию к эпителию слизистой оболочки. У С. diphtheriae выделяют три биовара — gravis, mitis и intermedius. Бактерии биовара gravis — короткие неправильной формы, с небольшим количеством метахроматических гранул. Биовар mitis образуют длинные изогнутые полиморфные палочки, содержащие лютиновые зёрна. Бактерии биовара intermedius имеют поперечные перегородки, разделяющие клетку на несколько сегментов.

С. diphtheriae хорошо окрашивается осными анилиновыми красителями, грамположительны. В мазках С. diphtheriae располагаются в виде «растопыренных пальцев», «иероглифов», латинской буквы V.

Культуральные свойства. Дифтерийная палочка хорошо растёт при 36-37°С; оптимальное значение рН 7,4-8,0. Питательные среды должны содержать аминокислоты, витамины, ионы (Са²⁺, Mg²⁺, Fe²⁺ и др.), играющие роль ростовых факторов. На сывороточных средах (среде Лёффлера) дают рост уже через 10-12 ч. Наибольшее распространение получили среды с теллуритом, так как возбудитель резистентен к высоким концентрациям теллурита калия или натрия, ингибирующим рост сопутствующей микрофлоры. На таких средах возбудитель образует сероваточёрные колонии в результате восстановления теллурита до металлического теллура. жидких средах образуют помутнение и осадок.

Биохимическая активность. С. diphtheriae сбраживает с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, галактозу, декстрин; не разлагает сахарозу, лактозу, маннит. Способность разлагать крахмал и гликоген варьирует у различных штаммов, что используют для внутривидовой дифференциации. Дифтерийная палочка не гидролизует мочевину и не образует индол. Отсутствие способности ферментировать сахарозу и разлагать мочевину — дифференцирующий признак, отшчащий дифтерийную палочку от других коринебактерий. Другой дифференцирующий признак - способность разлагать цистеин. С. diphtheriae продуцирует каталазу, гиалуронидазу, нейраминидазу, ДНКазу, уреазу и др. Цистиназная активность — дифференцирующий признак С. diphtheriae. Дифтерийная палочка лизирует эритроциты морской свинки и кролика. Биовары возбудителя дифтерии существенно различаются по культуральным и биохимическим свойствам. Среди дифференциально-диагностических биохимических тестов наиболее часто учитывают различия вспособности разлагать углеводы и мочевину. Дифтерийная палочка образует бактериоцины (корицины), обладающие узким спектром действия. Бактериоцины образуют как токсигенные, так и нетоксигенные штаммы.

Факторы патогенности

Экзотоксин термолабильный, высокотоксичный полипептид, имеющий фрагменты А (проявляет ферментативную активность) и В (взаимодействует с клеточными рецепторами, облегчая проникновение фрагмента А). С. diphtheriae продуцирует мощный экзотоксин — основной фактор патогенности. Нетоксигенные штаммы не вызывают развитие заболевания.

Идентификацию биоваров дифтерийной палочки проводят по способности разлагать глюкозу мальтозу, сахарозу, крахмал и мочевину. Бактерии биоваров gravis и intermedius разлагают глюкозу, мальтозу и крахмал. Бактерии биовара mitis разлагают лишь глюкозу и мальтозу. Все биовары дифтерийной палочки не разлагают мочевину, восстанавливают нитраты в нитриты. Дифтерийный токсин катализирует перенос АТФ-рибозы от цитоплазматического никотин-амиддинуклеотида (НАД) к фактору элонгации 2. Токсин ингибирует белковый синтез, в том числе в миокарде, приводя к структурным и функциональная нарушениям, способным вызвать смерть больного. При воздействии токсина на нервную ткань происходит демиелинизация нервных волокон, параличи и парезы.

Способность к токсинообразованию проявляют лишь лизогенные штаммы Corynebacterim diphtheriae, инфицированные бактериофагом (β-фаг), несущим ген tox, кодирующий структуру токсина.

Антигенная структура. У С. diphtheriae выделяют О- и К-антигены. Липидные и полисахаридные термолабильные фракции 0-Аг коринебактерий преимущественно представлены межвидовыми антигенами. Поверхностные термолабильные К-Аг (нуклеопротеиды, белки) обеспечивают видовую специфичность и проявляют выраженную иммуногенностъ. С помощью анти-К-сывороток дифтерийные бактерии разделяют на серологические варианты (около 58). Биовар mitis включай 40 сероваров, gravis — 14, intermedius— 4. В отечественной практике используют диагностические агглютинирующие, неадсорбированные сыворотки; в том числе полигрупповые и к сероварам для РА на стекле и в пробирках.

Патогенез поражений. Входные ворота для возбудителя — слизистые оболочки глотки, иногда глаз, половых органов (у женщин), повреждённые кожные покровы. Дифтерийная палочка колонизирует ткани в месте внедрения, вызывая развитие местного фибринозного воспаления. В однослойном цилиндрическом эпителии дыхательных путей формируется крупозное воспаление, на многослойном плоском эпителии образуется жёлто-серая фибринозная плёнка, плотноспаянная с прилежащими тканями. Разрастание плёнок и переход процесса на воздухоносные пути могут вызвать асфиксию. Возможные системные проявления обусловлены действием токсина, поражающего нервную систему (преимущественно периферические симпатические узлы), сердце и сосуды, надпочечникии почки. Ферменты патогенности С. diphtheriae (гиалуронидаза, нейраминидаза, фибринолизин) обеспечивают проникновение возбудителя в различные ткани, включая кровоток.

Продолжительность инкубационного периода заболевания составляет 2-12 сут. В зависимости от локализации процесса выделяют поражения ротоглотки (наиболее часто), дыхательных путей, носа и редкой локализации (глаза, наружные половые органы, кожа, раневые поверхности).

Микробиологическая диагностика

С целью раннего выявления заболевания и определения носителей необходимы выделение иидентификация возбудителя, а также определение его способности к токсинообразованию. Материалом для исследования служат дифтеритические плёнки, слизь из носоглотки или отделяемое из поражений кожных покровов. Забор материала проводят двумя стерильными тампонами: один используют для посева, с другого делают мазки и окрашивают их по Граму и Найссеру. Взятый материал следует доставлять в лабораторию не позднее чем через 2 ч.

• Бактериоскопия. Окраска по Граму не является специфичной, так как бактерии сравнительно плохо воспринимают красители, но позволяет косвенно идентифицировать непатогенные коринебактерии, располагающиеся в виде палисада (параллельно) или в виде китайских иероглифов. Окраска по Найссеру позволяет отличить дифтерийную палочку от ложнодифтерийной палочки С. pseudodiphtheriticum (С. hofmannii), часто обитающей в носоглотке.

• Культивирование. Бактерии выделяют посевом на элективные среды с теллуритом ложнодифтерийная палочка теллур не восстанавливает.

• Для выделения чистой культуры часть подозрительной колонии засевают на скошенный агар (или среду Ру), вторую часть — на твёрдую питательную среду для определения токсигенности и (не обжигая петли) проводят определение цистиназной активности (проба Пизу). При положительном результате наблюдают образование коричневого облачка вокруг линии укола. Чистую культуру идентифицируют на средах Хйсса, пользуясь укороченным «пёстрым» рядом (глюкоза, мальтоза, сахароза, мочевина), что позволяет отличить С. diphtheriae от непатогенных коринебактерии. Для идентификации биоваров используют «длинный» ряд углеводов, включающий крахмал и гликоген. дом диагностики дифтерии. Материал засевают на кровяной агар и элективные питательные среды, содержащие теллурит: среда Клауберга (питательный агар с теллуритом натрия, глицерином и дефибринированной кровью) и др. На средах с теллуритом задерживается рост кокков и другой микрофлоры зева, что способствует размножению возбудителя дифтерии. На теллуритовой среде С. diphtheriae образует черные колонии за счет восстановления теллурита (биовар gravis формирует колонии серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью поверхности, напоминающие цветок маргаритки, биовар тitis — круглые выпуклые колонии черного цвета. Характерные колонии, пересевают на кровяной агар для получения чистой культуры.

Для подтверждения диагноза дифтерии в первую очередь необходимо установить токсигенность выделенной культуры. Наличие токсина определяют с помощью различных серологических реакций (преципитации в агаре, ИФА, ПЦР и др.). Методы ИФА и ПЦР являются более чувствительными и позволяют получить результат в течение 3—5 ч.

Выделенную культуру идентифицируют и дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по морфологическим особенностям, культуральным и биохимическим признакам: пробы на цистиназу, уреазу, ферментация углеводов и др. В случае выделения нетоксигенной культуры ставят дополнительную реакцию агглютинации.

Фаготипирование. Для дифференциальной диагностики возбудителей используют набор из 9 коринефагов. С его помощью можно типировать большинство токсигенных и нетоксигенныхштаммов биовара gravis.

Лечение. Поскольку патогенез пажений обусловлен действием токсина, то основу специфической терапии составляетпротиводифтерийная лошадиная сыворотка (антитоксин), содержащая не менее 2000 международных антитоксических единиц активности (ME) в 1 мл. Антитоксин вводят внутримышечно или внутривенно в дозах, соответствующих тяжести заболевания (от 20 000 до 100 000 ЕД).

ДИФТЕРОИДЫ

По морфологическим и культуральным свойствам с возбудителями дифтерии сходна большая группа бактерий рода Corynebacterium, обозначаемых как коринеформные бактерии, или дифтероиды. Они широко распространены в окружающей среде — в воздухе, почве, пыли, воде, в некоторых пищевых продуктах. От человека их наиболее часто выделяют со слизистой оболочки носоглотки. Большинство видов представлено организмами-комменсалами, например С. pseudodiphtheriticum - палочка Хофманна) и С. xerosis, но также имеются виды, вызывающие спорадические поражения человека (С. ulcerans, C.jeikeium, С. urealyticum, С. minutissimum и др.).