- •Лекция 1 о патогенности микроорганизмов. Задачи и методы клинической микробиологии
- •3. Молекулярно-биологические методы
- •4. Неспецифические тесты
- •Лекция 2 Патогенные и условно-патогенные кокки
- •Развитие инфекционного процесса
- •Таксономия и систематика рода Staphylococcus
- •1881 – Открыт л. Пастером 1884 – к. Френкель и а. Вейксельбаум доказали его этиологическую роль в развитии пневмонии
- •Общая характеристика сем. Enterobacteriaceae
- •Деление e.Coli на группы по патогенности и проявлению клинических симптомов:
- •2. Характеристика сем. Vibrionaceae
- •Вибрионы нео1(наГи)
- •2.Подвижность (жгутик содержит адгезины) 3. Хемотаксис 4. Факторы адгезии и колонизации 5. Ферменты: муциназа, протеазы, нейраминидаза, лецитиназа 6. Эндотоксин 7. Бактериоцины
- •Характеристика патогенных вибрионов
- •Характеристика c. Diphtheriae
- •Основной фактор патогенности
- •Антигенные комплексы y. Pestis
- •Bacillus anthracis - сибирская язва
- •3 Морфологические формы: 1. Вегетативная бескапсульная 2. Вегетативная капсульная – полипептид 3. Споровая
- •Компоненты и принцип действия экзотоксина Bacillus anthracis
- •Лекция 8 Возбудители туберкулеза
- •К ультуральные свойства мбт
- •Возбудитель болезни Лайма b. Burgdorferi
- •Лекция 11 Условно-патогенные микроскопические грибы
- •Классификация микозов по н. Д. Шеклаковой (1976)
- •Лекция 13 Медицинская вирусология. Возбудители орви
- •2009Г. «Свиной грипп» h1n1sw (реасортант) 18 тыс. Подтвержденных случаев летальных исходов (воз) Возможный кандидат h5n1 (2007г)
- •Защитные механизмы при вирусной инвазии и репликации
- •Лекция 14 Возбудители вирусных гепатитов человека (вгч)
- •2 Группы вг гр. Вгч с парентеральным механизмом передачи инфекции - Blood born hepatitis virus гр. Вгч с энтеральным механизмом передачи инфекции - Food born hepatitis virus
- •Классификация вирусов гепатита
- •Пути передачи вирусов гепатита
- •Маркеры вгв на разных стадиях развития инфекции
- •Особенности репродукции вгс
- •Почкование вич - budding
- •Геном вич
- •Типы клеток, поражаемых вич
- •Азидотимидин, зальцитабин, эфавиренц тератогенны
- •16 Лекция Вирусы гепатита а и е
- •Жизненный цикл пикорна- и калицивирусов (вг а и е)
- •16 Лекция Прионы - особые инфекционные агенты pr-protein in-infection Полиморфное семейство инфекционных белков, имеющих общие структурные особенности
3. Молекулярно-биологические методы
Методы выявления ДНК или РНК возбудителя (ПЦР) PCR Методы определения структуры 16S рРНК малой субъединицы бактериальной рибосомы – метод риботипирования ПЦР (PCR) - Полимеразная цепная реакция -метод выявления ДНК или РНК возбудителя
ПЦР Разработал амер. исс.- Кэрри Муллис, Ноб. лауреат 1993г. 1985г. in vitro - репликация участков ДНК.
Цель - обнаружение незначительных количеств ДНК (вирусной, бактериальной, простейших) в клиническом материале от больного. Не является абсолютно точным (случаются ошибки), но он очень специфичен, т.к. основан на уникальном свойстве ДНК – комплементарности, при этом должно произойти взаимодействие участков ДНК возбудителя из клинического материала от больного и имеющихся в диагностическом наборе фрагментов ДНК-возбудителя – праймеров.
Метод PCR включают несколько этапов 1. выделение ДНК 2. амплификация 3. детекция
Материал: кровь, любая ткань, моча, кость, соскобы со слизистых специальными щеточками. Идентификация останков тоже осуществляется этим способом, т.к. в костях ДНК сохраняется много десятков лет. Этот этап очень ответственный, необходимо использовать специальные приемы для взятия материала, правильной транспортировки. Лучше всего брать материал и сразу же проводить исследование. Амплификация - умножение ДНК возбудителя из клинического материала. 25-35 циклов умножения. Теоретически можно иметь всего 1 копию ДНК возбудителя в клиническом материале и ее размножить. Детекция - определение интересующих фрагментов ДНК – нуклеотидов.
Комплект для PCR ДНК-возбудителя из кл. материала – фрагмент нуклеотидов, который нужно определить. Смесь нуклеотидов – супермикст, из которых будет строиться новые, вновь синтезируемые фрагменты ДНК. Затравки-праймеры – искусственно синтезированные фрагменты ДНК (олигомеры), Соответствующие фрагментам ДНК определенных возбудителей. Они нужны для того, чтобы начался синтез новой цепочки ДНК только в том случае, если ДНК-возбудителя из клинического материала комплементарно совпадет с ДНК-затравкой, соответствующей ДНК предполагаемого возбудителя. ДНК-полимераза (термостабильная) – фрагмент, сшивающий нуклеотиды (из термофильной бактерии Thermus aquaticus).
Условия проведения ПЦР Объемы реактивов, используемые в работе: Объем супермикса – 20 мкл Объем ДНК-полимеразы – 20 мкл Обязательное условие – соблюдение идеальной чистоты!!!
Этапы амплификации - 1-й этап денатурация (ДНК возбудителя из клин. материала) Т° = 94°С → 2 цепочкирасходятся, рвутся водородные связи между азотистыми основаниями →1-цепочечные молекулы ДНК. С этого момента 1-цеп. молекулы ДНК возбудителя называются – амплификатор 1 и 2. - 2 этап - связывание (отжиг) праймеров к амплификатору амплификатор 1 связывается с праймером 1, амплификатор 2 с праймером 2 Связывание происходит в случае комплементарного совпадения участка праймера с амплификатором. Праймеры должны соответствовать предполагаемым возбудителям. При 62°С. 3-й этап – синтез новой цепи ДНК ДНК достраивается из нуклеотидов супермикста. Строится ампликон. Именно эту реакцию осуществил Кэрри Муллис в 1985г. Скорость синтеза – 1 нуклеотид/ 1 мин. Все повторяется примерно 30 раз. Занимает 2,5 часа. При 72°С (оптимальная температура для работы термостабильной ДНК-полимеразы.
Детекция - существует несколько способов: Электрофорез в агарозном геле ДНК – гибридизация ИФА на микрочастицах
PCR характеризуется 2 важными параметрами Высокая чувствительность Высокая специфичность
Чувствительность зависит от - Интенсивности инфекционного процесса - Правильного отбора проб - Сроков и условий транспортировки материала - Правильного выделения ДНК из материала - Качества реактивов - Точности этапа амплификации - Эффективности системы детекции результатов