Интерпретация результатов определения чувствительности

На основании получаемых количественных данных (диаметра зоны подавления роста антибиотика или значения МПК) микроорганизмы подразделяют на чувствительные, умеренно резистентные и резистентные (рис. 4). Для разграничения этих трех категорий чувствительности (или резистентности) между собой используют так называемые пограничные концентрации (breakpoint) антибиотика (или пограничные значения диаметра зоны подавления роста микроорганизма).

Рис. Интерпретация результатов определения чувствительности бактерий в соответствии со значениями МПК.

Пограничные концентрации не являются неизменными величинами. Они могут пересматриваться, в зависимости от изменения чувствительности популяции микроорганизмов. Разработкой и пересмотром критериев интерпретации занимаются ведущие специалисты (химиотерапевты и микробиологи), входящие в специальные комитеты. Одним из них является Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам США (National Committee for Clinical Laboratory Standards - NCCLS). В настоящее время стандарты NCCLS признаны в мире и используются как международные для оценки результатов определения чувствительности бактерий при многоцентровых микробиологических и клинических исследованиях.

Существуют два подхода к интерпретации результатов определения чувствительности: микробиологический и клинический. Микробиологическая интерпретация основана на анализе распределения значений концентраций антибиотика, подавляющих жизнеспособность бактерий. Клиническая интерпретация основана на оценке эффективности антибактериальной терапии.

Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) - наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая при исследовании in vitro вызывает гибель 99,9% микроорганизмов от исходного уровня в течение определенного периода времени.

Значение МБК используют при терапии антибиотиками, обладающими бактериостатическим действием, или при отсутствии эффекта от антибактериальной терапии у особой категории больных.

В настоящее время созданы микробиологические системы, автоматизированной и полуавтоматизированной микробиологические, идентификации и оценки антибиотикоустойчивости, позволяющие существенно ускорить бактериологический анализ, повысить степень его точности.

Бактериальные анализаторы - высокочувствительная технология лазерного светорассеяния позволяет фиксировать кинетику роста микроорганизмов в образце в режиме реального времени, что позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью определять наличие жизнеспособных микроорганизмов в исследуемом образце, а также антибиотикочувствительность исследуемых культур всего за несколько часов.

Рис. Определения антибиотикочувствительности с помощью баканализатора.

Осуществляется мониторинг фазы роста бактерий в специальных культуральных бульонах, выстраиваются при этом кривые бактериального роста в режиме реального времени и производя бактериальный подсчет в КОЕ/мл.

Все образцы инкубируются при 37 °С и анализатор осуществляет детекцию только жизнеспособных бактерий, отделяя их от таких образований, как эритроциты, лейкоциты, мертвые клетки и кристаллы солей, присутствующие в образце и элиминируемые при помощи специальных настроек прибора.

Определение антибиотиков в биологических жидкостях.

Концентрация антибиотиков в тканях и жидкостях организма, как и их антимикробная активность, относятся к основным параметрам, определяющим эффективность антибиотикотерапии. При ее изучении наиболее широко применяют микробиологические методы исследования, основанные на способности биологической жидкости, содержащий антибиотик, задерживать рост тест-микроба. Среди микробиологических методов определения концентраций антибиотиков в жидкостях и тканях организма наибольшее распространение получили метод диффузии в агар и метод серийных разведений в жидкой питательной среде.

Для определения антибиотика в биологических жидкостях (плазме крови, моче и др.) с высокой степенью точности необходимо:

1. Разведения изучаемого субстрата в физиологическом растворе 1:2, 1:5, 1:10, 1:20.

2. Чашки Петри со средой и тест-микробом.

3. Рабочие растворы стандарта антибиотика для построения калибровочной кривой.

Приготовленные растворы стандарта антибиотика и испытуемые растворы (нативная плазма крови и ее разведения, супернатант трахеобронхиального аспирата и его разведения) вносят в лунки агара с помощью пипетки в объеме 0,1 мл, чередуя стандартный и испытуемые растворы. Для каждого испытания используют не менее 3 чашек. Чашки инкубируют при 37°С в течение 18 часов.

Расчет активности испытуемого антибиотика в биожидкостях проводят по общепринятой стандартной схеме:

Концентрацию антибиотика в испытуемом субстрате определяют по стандартной калибровочной кривой. Для построения стандартной кривой используют 5 концентраций раствора стандартного препарата: 0,125; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 мкг/мл.

Одна из концентраций, по которой вносят поправки, является контрольной (для каждого препарата существует стандарт). Для каждой концентрации, кроме контрольной, используют 3 чашки (всего 12 чашек). В 3 лунки каждой чашки вносят растворы контрольной концентрации, в 3 другие лунки - одну из взятых концентраций раствора. После измерения зон задержки роста для каждой концентрации выводят среднюю величину зоны на трех чашках, затем находят среднюю величину зоны для контрольной концентрации на всех чашках (12 чашек × 3 зоны=36 зон).

По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации, выведенной на 12 чашках, и средней величиной зоны контрольной концентрации, определенной из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией, находят поправку к величине зоны данной концентрации. Поправку прибавляют к средней величине зоны данной концентрации, если она положительная, и вычитают, если поправка отрицательная.

Стандартную кривую строят на полулогарифмической сетке по исправленным значениям величин зон взятых концентраций и средней величине зоны контрольной концентрации. По оси абсцисс откладывают диаметр зоны задержки роста тест-штамма, а по оси ординат - значения концентраций антибиотика.

При определении концентрации антибиотика в биологических жидкостях в зависимости от количества субстрата используют одну или несколько чашек для этого субстрата и каждого его разведения. Параллельно с испытуемым материалом в лунку каждой чашки вносят контрольную концентрацию стандартного раствора. После инкубации при 37°С в течение 18 часов измеряют зоны задержки роста тест-микроба, образуемые контрольной концентрацией стандарта и испытуемым раствором. Разность между найденными средними величинами зон испытуемого образца и контрольной концентрации прибавляют к величине зоны контрольной концентрации на стандартной кривой. Затем по кривой находят концентрацию, соответствующую найденной величине зоны в мкг/мл. Полученную концентрацию умножают на степень разведения и, таким образом, определяют содержание антибиотика в 1 мл испытуемого материала. Точность метода ±10%.

Возможно применение модифицированного метода серийных разведений:

В штатив устанавливают два ряда пробирок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом — исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штамм S. aureus, а при определении стрептомицина — Е. coli. После инкубирования посевов при 37 °С в течение 18—20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-бактериями. Концентрация антибиотика определяется умножением наибольшего разведения исследуемой жидкости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, равно 1:1024, а минимальная концентрация эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение 1024х0,313=320 мкг/мл составляет концентрацию антибиотика в 1 мл.

Определения концентрации антибиотика в биологических позволяет применять индивидуальные схемы антибактериального лечения с учетом фармакокинетики этого препарата и чувствительности возбудителей, а также разработать стандартные схемы его применения у лиц, требующих индивидуальные схемы лечения (новорожденные дети, пожилые лица, пациенты с нарушением функций почек, печени) с различной степенью зрелости организма и тяжестью инфекционного процесса.

Имеются ускоренные физико-химические и химические методы (иммуноферментный, иммунофлюоресцентный и др.) изучения фармакокинетики антибиотиков, помогающие быстро оптимизировать схемы лечения, индивидуализировать их и повысить эффективность этиотропной терапии.