13. Препарати гормонів, ферментів з рослинної та тваринної сировини.

Препарати біогенних стимуляторів та препарати з свіжої рослинної сировини.

Історія цих препаратів бере початок з древніх часів. В народній медицині як біостимулятори використовувались яди пчіл, ядовитих риб. Першим був Парацельс, використавши зміїну отруту.(16 ст.). Важливі продукти бджільництва (прополіс, перга, препарат «Апілак»,аерозольний препарат «Пропосол», мазь «Пропоцеум», настоянка пропол). Особливість препаратів біогенних стимуляторів в тому, що вони викликають активізацію захисних сил організму, головним чином ферментних систем, імунобіологічної реактивності, нормалізацію гормональних функцій.

Останнім часом створено великі потужності поточного промислового виробництва препаратів біогенних стимуляторів. На Одеському ВО «Біостимулятор» отримують препарати рослинного, тваринного та мінерального походження. Приклади: екстракт алоє рідкий – використовують нижні листочки двохрічної рослини. Залишають для біостимулювання в темноті на 10-12 діб, подрібнюють і заливають водою, настоюють, кип’ятять, фільтрують, перевіряють окисність.

Скловидне тіло – отримують з біостимульованих очей (по Філатову) великої рогатої худоби. Дезинфікують, обробляють фіз. розчином, роблять надріз і вакуумним пістолетом дістають скловидне тіло і заморожують. Піддають обробці в реакторі (Т 115 ), охолоджують, освітляють і стерилізують. використовують як розсмоктуючий та обезболюючий при невралгіях препарат.

Широке застосування мають плацентарні препарати, (аміноцен), з хрящів і трахей ВРХ, (Хонсурид, Румалон), з крові людини (плазмол), з селезінки ВРХ (спленін), з крові тварин (Солкосерил, актовегін).

Препарати з свіжих рослин – особливість їх в тому, що в них міститься весь комплекс БАР, що входять до складу рослини в найбільш природному стані (під час сушки та зберігання БАР піддаються змінам). Після 1,5-2 років зберігання сухої сировини їх кількість (особливо глікозидів і еф. масел) різко зменшується. Настоянка із свіжого коріння валеріани у 3 рази ефективніша ніж з сухого коріння.

Сучасні препарати з свіжої сировини відносять до двох груп - соки і витяжки.

Технологія соків – сировину подрібнюють у вальцях, закладають в полотняні мішки і пресують, до 85 частин соку додають 15 ч-н етанолу, швидко нагрівають і охолоджують (для інактивації ферментів та згортання білка), центрифугують та додають консервант

(етанол або хлорбутанолгідрат). Виготовляють : сік подорожника, каланхоє. Настоянки з свіжої сировини: настоянка валеріани (готують на 70% етанолі, перколяція, містить ефірне масло, валеріанову кислоту, борнеол, алкалоїди, дубильні речовини, цукри.

Препарати мінерального походження – з ілової лікувальної грязі Куяльницького лиману Одеської області готують екстракт лікувальної грязі «Пелоїдин». (загрузка в керамічний бак, додають воду та хлорид натрію і настоюють при постійному перемішуванні, фільтрують двічі. Отримують водний екстракт).

ПРЕПАРАТИ ГОРМОНІВ

Гормони (від грецького hormao – приводити в рух, збуджувати) –біологічно активні речовини різної хімічної природи, які утворюються спеціалізованими клітинами залоз внутрішньої секреції, виділяються безпосередньо в кров, лімфу та регулюють обмін речовин та фізіологічні функції організму. Нараховується біля 60 біологічно активних секретів, які виробляються ендокринними залозами і мають гормональну активність.

Гормони та гормональні препарати класифікують за хімічною структурою:

1. Гормони білкової природи: прості (інсулін, пролактин, гормон росту ) та складні (фолатропін, лютропін, тиротропін)

2. Гормони пептидної природи: глюкоген, кальцитонін, соматостатин, вазопрессин, окситоцин.

3. Гормони ліпоїдної природи(стероїдні): кортикостероїди, адреногени- естрогени.

4. Гормони –похідні аміноспиртів: адреналін, окситоцин, норадреналін.

5. парагормони, тканинні гормони: гастрин, секретин, гепарин).

Отримують гормони ендокринних залоз методом хімічного синтезу, методом генної інженерії. Зараз інтенсивно розвивається фізико-хімічний та генетичний напрям в біотехнології. Методами генної інженерії отримані штами - продуценти пептидних гормонів (інсуліну, соматропіну). Отримання гормонів методом біосинтезу є більш економічно ефективним (так як не потребує високих Т, Р, каталізаторів). Виробництво препаратів розглянемо на прикладі інсуліну. Інсулін –препарат підшлункової залози. За хімічною природою – білок. Вперше був виділений а Канаді з підшлункової залози собаки при обробці її підкисленим етанолом. Перші кристали інсуліну були отримані в 1952 році завдячуючи впровадженню новітніх методів очистки гормону.(імуноелектрофорез та рідинна хроматографія) від інших гормональних речовин. Його виділяють із підшлункових залоз рогатої худоби та свиней. Приклад найбільш ефективного способу отримання інсуліну включає ряд стадій:

1. Подрібнення заморжених залоз і екстракція кислим спиртовим розчином.

2. Осадження баластних речовин (білків) і звільнення від ліпідів.

3. Ізоелектричне осадження фракції інсуліну і осадження спиртом, ацетоном, ефіром.

4. Очистка інсуліну: осадження солями. Фракціонування методами хроматографії (сульфокатіоніт),гель-фільтрація.

5. Осадження в вигляді кристалів.

6. Переосадження цинк-інсуліну.

Свіжі або заморожені підшлункові залози подрібнюють на м’ясорубці, і екстрагують способом бімацераціі перший раз 80- 85% етанолом в реакторі з мішалкою, Другий раз екстрагують 57% етанолом, підкисленим до рН 2,8-3.Екстракцію проводять 1,5-4 год. при перемішуванні. Підкислений спирт сприяє інактивації трипсину, завдяки цьому вдається зберегти інсулін в незмінному стані. Витяжки об’єднують, залишають на холоді на 48 год. для звільнення від небажаних білків ,що випадають в осад. Осад видаляють центрифугуванням. Далі для виділення і очистки інсуліну використовують іонообмінну хроматографію. Здійснюють сорбцію інсуліну з прозорої рідини на макропористому сульфокатіоніті при рН 3-3,3 . Жир видаляють промивкою катіоніту 65-67% етанолом, баластні білки видаляють промиванням 0,3 М розчином ацетатного буферу. Десорбцію здійснюють швидко 0,01-0,05 М розчином амонійного буферу (при рН 10) і швидко підкисляють кислотою НС до рН 4,5 і додають ацетон. Осад баластних речовин видаляють. Інсулін осаджують

Багато фарм. компаній проводять багатомасштабні роботи по вдосконаленню технології . Датська компанія «Ноro indastry» виробляє інсулін методом, в основі якого лежить заміна залишку аланіну в ланцюгу В на залишок треоніну. Це роблять шляхом ферментативного заміщення та наступною очисткою продукту. (так був отриманий однокомпонентний інсулін, що містиь 99% чистого препарату.). Американська компанія «Елі Ліллі» з1980 р. використовує іонообмінну хроматографію на стадії додаткової очистки. Це найкрупніша компанія по розробці технології інсуліну методами генної інженерії.

Сьогодні випускається інсулін для інє’кцій, суінсулін, ( цукрознижуючий ефект через 15-20 хв. На протязі 6 год., рідше викликає алергію), суспензія інсулін – протамін (готують з кристалічного інсуліну з додаванням фосфату натрію та сульфату протаміну, ефект наступає за 2-4 год. І триває 16-18 год.), суспензія цинк-інсуліну аморфного (стерильна суспензія інсуліну з хлоридоим цинку в буферному ацетатному розчині, цукрознижуючий ефект через 1-1.5 год. на 10-12 год.), суспензія цинк-інсуліну для інє’кцій(ефект через 2-4 год. І досягає максимуму через 8-10 год. і триває 24 год.), суспензія цинк-інсуліну кристалічного ( це кристали, не розчинні в воді, ефект наступає через 6-8 год. і продовжується 30-36 год. По характеру дії близький до зарубіжного Insulinum Itralente.

Останнім часом розроблено нові, очищені від проінсуліну та високомолекулярних білків препарати. Вони краще переносяться і не викликають алергічних реакцій: моноінсулін, суспензія інсулін- семілонг та інсулін – лонг та ультралонг. Крім моноінсуліну( препарат короткої дії) всі останні – пролонгованої дії

ПРЕПАРАТИ ФЕРМЕНТІВ

Ферменти входять до складу всіх клітин і тканин живих організмів і регулюють перебіг процесів, які лежать в основі життєдіяльності організму. Відомо біля 2000 ферментів, близько 100 з них отримані в кристалічному стані. Як і всі білки вони є високомолекулярними сполуками. Малостійкі, дуже чутливі до зміни рН середовища і Т.

Для кожного ферменту існує оптимальне значення рН, при якому швидість реакції максимальна ( активність трипсину має оптимум при рН 7,8, панкреатичної амілази – при 6, 7-7,2. Відхилення рН в ту чи іншу сторону веде до зниження швидкості ферментативної реакції).Ферменти, оптимальна дія яких знаходиться в нейтральному. або лужному середовищі повністю інактивуються в кислому середовищі шлунку. Оптимальна Т для більшості -20-40 С. Підвищена до 40-50 С приводить до зменшення ферментної активності, а іноді і денатураціі білків.

За типом реакції, яку вони каталізують , всі ферменти діляться на 6 основних класів:

1. Оксидоредуктази.; 2.Трансферази; 3. Гідролази; 4. Ліази; 5.Ізомерази; 6.Лігази.

Більша частина ферментів, які випускає промисловість –відносяться до гідролаз.

Розрізняють ферменти: прості білки, які при гідролізі дають тільки амінокислоти і

-ферменти-протеїни, використ. як лікарська та діагностична сировина (пепсин, трепсин, уреаза).

Складні ферменти ,як правило, мають простетичну групу небілкової природи (кофермент), звя’зану з білком. Роль коферментів в загальному процесі каталізу настільки важлива, що їх варто розглядати як окрему групу БАР з різними механізмами дії.

Так як дуже важко отримати ферменти в гомогенному стані, а вже існуючі препарати містять ще й супутні (крім основної) ензиматичні властивості, то промислові ферменти класифікують за основним компонентом: -амілотичні, ліполітичні, целюлозолітичні, протеолітичні. Набільш розвинена ферментна промисловість у США, Японії, Німеччині, Данії, та Франції.

Виробництво ферментів з сировини тваринного походження

Для промислового виробництва ферментів використовуються відходи м’ясопереробної промисловості (підшлункова залоза, слизисті оболонки кишківника свиней, сечуги великої рогатої худоби, молочних телят, сімянники статевозрілих тварин). Виробництво пов’язане з рядом труднощів: це переробка великих кількостей тканинних матеріалів та створення спеціальних умов для їх зберігання.

Препарати ферментів слизової оболонки шлунку

Пепсин –містить протеолітичний фермент. Сировина – слизова оболонка шлунку свиней,

Де він утворюється у вигляді профермента – пепсиногена. Пепсиноген активується хлористоводневою кислотою аутокаталітично. При цьому від нього спочатку відщеплюється залишковий поліпептид, а потім інгібітор пепсину. Утворюється активний пепсин. При виділенні протолітичного ферменту основна задача –це отримання його в активній формі. Тому екстракцію проводять з автолізом.

Подрібнені тканини заливають водою, підкисленою НС рН 1,9-2,3.(співвідношення 1:10). Настоюють при Т=40 С продовж 32 год. ,перемішуючи. Лізати зливають, відокремлюють від верхнього слою жиру, з’єднують, проціджують. Ферментну масу виділяють висалюванням – до лізату при безперервному перемішуванні додають 20=25%NaCl пепсин випливає на поверхню. Його відділяють, сушать, подрібнюють і просіюють. Використовують при шлункових розладах.

Сік шлуновий натуральний- отримують методом І.П.Павлова (через фістулу шлунка при мінімальному годуванні собак або коней). Консервують саліциловою кислотою.

Препарати ферментів підшлункової залози.

Панкреатин – містить ферменти трепсин, амілазу і незн. к-ть ліпазу. Виготовляють з підшлункової залози ВРХ і свиней.. В цій залозі протеолітичні ферменти утворюються у вигляді проферментів: трипсиногена, хімотрипсиногена. Активування проферментів проводять в екстракті в лужному середовищі в присутності іонів Са і з затравкою.

Тканини підшлункової залози подрібнюють, заливають водою, підкисленою оцтовою льодяною к-тою. Настоюють в реакторі з мішалкою 4 год. При 10 С. Екстракт відділяють центрифугуванням або проціджуванням з подальшим пресуванням осаду. Для активування проферментів в екстракті створюють рН 8,1, додають хлорид кальцію, затравку і знову настоюють. Екстракт підкисляють і в ізоелектричній точці осаджують супутні речовини.. Осад обезжирюють ацетоном, сушать і розмелюють у шаровій мішалці.

До препаратів ферментів підшлункової залози ВРХ також відносяться: дезоксирибо-

нуклеази (ДНКази), рибонуклеази(РНКази), трипсин, хімотрипсин, інгібітор нуклеаз

(пантрепсин та інсулін), еластолітин, цитохром С (з тканин серця), холензим (слизова тонкого кишківника), хімопсин, фібринолізин та очні плівки (з плазми крові). Подрібнену сировину піддають автолізу, потім екстракція методом бісмацерації водою. Жмих використовують для виробництва інсуліну а з екстракту висолюють ферменти сульфатом амонію.

У багатьох випадках препарати виготовляють на виробництвах при м’ясокомбінатах.

Виробництво ферментів з рослинної сировини

Перевагою виробництва ферментів з рослинної сировини є те, що заготівля їх технологічно проста і висушений матеріал можна добре зберігати. Для виділення ферментів часто використовують насіння рослин. Вони багаті на білки і можуть зберігати ферментну активність протягом декількох років, але вміст ферментів в різних частинах рослин не однаковий.

В промислових масштабах використовують наступну сировину:

-плоди динного дерева – папаїн, хімопапаїн;

-плоди та листя інжиру – фіцин,

-плоди, стебла, відходи переробки ананасів – бромелін;

- картопля –кисла фосфатаза;

- коріння хріну – пероксидаза.

Єдина в країнах СНД лабораторія ферментних препаратів вперше отримала такі препарати:

-ліпазу - з насіння чорнушки;

-уреазу- з столових гарбузів (вик для апарату «штучна нирка»);

-В-амілазу із проростків пшениці;

-В-галактозидазу – з насіння гороху;

-інгібітор ліпази з насіння рапсу

Для виробництва ферментів також можуть бути використані продукти бджільництва. Відомо, що мед має яскраво виражену активність ферменту амілази.

Ферменти в рослинній сировині знаходяться у вигляді складних комплексів і для того, щоб отримати їх в кристалічному стані і біологічно активними , підбирають такі методи виділення, при яких не губилась би їх специфічна активність (екстрагент підбирається для

кожної рослини індивідуально: вода, водні розчини органічних розчинників, розбавлені розчини кислот і лугів, розчини нейтральних солей, буферні розчині).

Сировину піддають подрібненню для зруйнування клітин. Далі екстрагують. Екстракт містить поряд з ферментами речовини не ферментної природи. Виділення супутніх компонентів та отримання високо очищеного продукту потребує різних методів. На першій стадії використовується кислотна денатурація (зміною рН переводять білки в нерозчинний стан. Застосовують також осадження неактивних домішок солями важких металів. А для очистки від компонентів, що відрізняються за розмірами молекул проводять діаліз через мембрани з певною величиною пор( целлофан, пергамент, коллодій). Використовують також мембрани з целюлози та її похідних.

Після попередньої очистки екстракт піддають 1- фракціонуванню органічними розчинниками використовують спирти (етанол, метанол, ацентон, диетилкарбінол),

2- нейтральними солями (сульфат амонію, сульфати та ацетати натрію та магнію),

3-сорбціі-десорбції на різних адсорбуючих матеріалах (активоване вугілля, крохмаль, целюлоза), 4-очищають іонообмінними смолами (використовують катіоніти з кислою реакцією (карбоксиметилцеллюлозу –КМЦ, фосфоцелюлозу ФЦ)), 5- гель-фільтрують

Приміняють сефадекси( полімерні ланцюги полісахариду декстрину – вони утворюють молекулярні сита, що здатні розділити білки за їх мол. масою).

Для концентрації використовують ультрафільтрацію ( розділення високомолекулярних та низькомолекулярних сполук на селективних мембранах, які пропускають низькомолекулярні сполуки під тиском. Кристалізація ферменту –заключний етап, але кристалічний стан не є критерієм гомогенності ферментного білка і тому можливий диск- електрофорез, ультрацентригування.