2. Указания к занятию:
-
Внимательно изучите инструкцию.
-
Приготовьте рабочие растворы для биохимического исследования активности ЩФ в сыворотке крови.
-
Осмыслить ход выполнения лабораторной работы.
-
Соблюдайте меры предосторожности в работе с реактивами, приборами.
-
При работе с пипетками используйте резиновую грушу с переходником. Работайте в перчатках!
3. Практическая часть.
-
Приготовление рабочих растворов.
1. Раствор NаОН – 20 ммоль/л.
Ход приготовления: Из набора реактивов взять флакон с NаОН, 200 ммоль/л и из него налить в мерный цилиндр 20 мл раствора NаОН, перенести в колбу объемом 200 мл, добавить 180 мл бидистиллированной воды, хорошо размешать! Хранить в пластиковой герметичной таре.
-
Рабочий реагент.
Ход приготовления: Смешать 80 мл глицинового буфера (реактив № 1) и 20 мл субстрата (реактив № 2). Полученный реагент стабилен 10 дней при t 2-8°С в темноте.
-
Лабораторная работа № 1. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови.
ПРИНЦИП: В случае ферментативного гидролиза р-нитрофенолфосфата образуется р-нитрофенол, который в щелочной среде приобретает желтое окрашивание. Скорость образования пара-нитрофенола пропорциональна активности ЩФ.
ЩФ
р-нитрофенилфосфат
+ Н2О
р-нитрофенол + фосфатарат
Оборудование и реактивы: штатив с пробирками; микропипетка на 0,02, пипетки на 1 мл, 2 мл; набор реактивов «Абрис +»; водяная баня, ФЭК, спектрофотометр.
Материал для исследования: сыворотка крови.
Процедура анализа.
|
Поместить в пробирки |
Опытная проба, мл |
Контроль на реактивы для опытной пробы, мл |
Калибратор, мл |
Контроль на реактивы для калибратора, мл |
|
|
Рабочий реагент |
0,2 |
0,2 |
- |
- |
|
|
Сыворотка крови |
0,02 |
- |
- |
- |
|
|
|
Смешать и инкубировать в водяной бане при 37°С 30 минут. |
||||
|
NаОН, 20 ммоль/л |
2,0 |
2,0 |
1,62 |
2,2 |
|
|
Сыворотка крови |
- |
0,02 |
- |
- |
|
|
Калибратор |
- |
- |
0,6 |
- |
|
Смешать. Измерить оптическую плотность пробы (Епр) и калибратора (Екалибр.) против соответствующих контролей на реактивы при длине волны 405 (400 – 420) нм и d = 1 см.
Примечание:
-
окраска стабильна не менее 30 минут после окончания инкубации при предохранении от прямого солнечного света;
-
при активности ЩФ, превышающей 120 МЕ/л, исследуемый образец следует развести физиологическим раствором. При расчете активности учесть степень разведения.
-
Расчет:
-
Референтные пределы: 17 – 50 МЕ/л.
Приложение № 4.
Закрепление знаний, умений и навыков.