2. Приготовление рабочих растворов для выполнения лабораторной работы.

Приложение № 3.

Инструкция по выполнению практической работы № 30 по теме

«Ферменты. Количественное определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови методом „конечной точки”».

Цели занятия:

1. Закрепить теоретические знания по теме «Ферменты».

2. Закрепить навыки и умения в приготовлении растворов и реактивов.

3. Провести биохимическое исследование – количественное определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови.

Исходный уровень знаний и умений.

Учащийся должен знать:

1. Свойства ферментов, их биологическое и клиническое значение.

2. Особенности протекания ферментативного катализа.

3. Ферментативные методы исследования биохимических показателей.

4. Классы ферментов. Гидролазы, их функции.

5. Технику работы с наборами реактивов.

6. Технику дозирования, приготовления биологического материала, растворов и реактивов для анализа.

7. Технику инкубирования проб.

8. Технику и меры предосторожности в работе с ФЭКом, спектрофотометром.

9. Формулы для расчетов биохимических показателей.

Учащийся должен уметь:

1. Работать с химической посудой, пипетками, дозатором.

2. Работать с термостатом, спектрофотометром, ФЭКом.

3. Приготовить необходимые рабочие растворы из набора реактивов.

4. Приготовить опытные, калибровочные и контрольные пробы для определения активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови.

Структура занятия.

1. Теоретическая часть:

1. Повторить теоретический материал по теме «Ферменты».

2. Рассказ преподавателя.

Щелочная фосфатаза – металлопротеин, содержится в разных тканях. В состав активного центра фермента входит атом цинка. Считают, что он повышает активность фермента, обеспечивая конформационные изменения и гидролиз моноэфиров ортофосфорной кислоты. Активность фермента возрастает в присутствии ионов магния и хлора. Буферные системы, используемые при определении ЩФ, можно разделить на инертные (барбиталовый, бикарбонатный буфер), ингибирующие (содержащие глицин, пропиламин) и активирующие (включающие в свой состав аминометилпропанол, диэтаноламин, ТРИС-буфер).

Содержится ЩФ в костной ткани, паренхиме и стенках желчных протоков печени, клетках слизистой оболочки кишечника, эпителии канальцев почек, плаценте и других тканях и органах.

Активность ЩФ обнаружена в большинстве биологических жидкостей, включая мочу, экскременты, желчь, слюну, молоко и лимфу.

Щелочная фосфатаза имеет изоформы; каждый изоэнзим сосредоточен в определенном органе. В организме человека три гена кодируют биосинтез фермента: один – печеночный, костный и почечный изоферменты, другой – кишечный изофермент, третий – плацентарную ЩФ. Считают, что в жировой ткани есть изофермент ЩФ.

В норме у взрослых людей в плазме (сыворотке) крови обнаруживается лишь ЩФ печеночного происхождения. У детей в сыворотке крови содержится значительное количество костной ЩФ; в небольшом количестве она может встречаться у юношей до 25 лет. После окончания формирования скелета присутствие её в сыворотке крови свидетельствует о наличии в организме доброкачественных или злокачественных остеопатий.

В последнее время особое внимание онкологов привлекают изоферменты ЩФ, используемые как маркеры онкологических заболеваний: плацентарный, плацентарноподобный, образованные как в злокачественных опухолях, так и в сыворотке.

Внедрение в клиническую биохимию техники определения с использованием моноклональных антител дало возможность разработать метод, позволяющий специфически выявлять отдельные изоферменты ЩФ. Радиоиммунологические исследования с применением моноклональных антител позволяет надежно обнаруживать в крови маркеры новообразований. Несмотря на высокую специфичность, эти методы пока не находят должного широкого применения в диагностике заболеваний вследствие высокой стоимости оборудования и тест-систем.