Биомедицина теория

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОМЕДИЦИНА

Часть 1

Учебное пособие для вузов

Воронеж Издательский дом ВГУ

2014

1

Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного факультета 15 мая 2014, протокол № 9

Составители: О.А. Сафонова, А.А. Агарков, М.В. Лущик, А.В. Семенихина, Т.Н. Попова

Рецензент профессор кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского государственного университета, д-р биол. наук, профессор Т.А. Ковалева

Учебное пособие подготовлено на кафедре медицинской биохимии и микробиологии биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.

Рекомендуется для студентов биолого-почвенного факультета 4-го курса очной и очно-заочной форм обучения, для магистрантов 1-го года обучения.

Для направлений 020400 и 020400м – Биология

2

3

ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ

Введение

Как известно, большинство обычных лекарств действуют на уровне белков, а не на уровне кодирующих их генов. В случае инфекционных болезней или рака ожидаемый эффект от лечения такими лекарствами – это полное выздоровление (в лучшем случае), т.е. патоген или группа аномальных клеток должны быть полностью уничтожены. Однако при наследственных заболеваниях лекарства способны лечить лишь симптомы, в то время как лежащий в основе болезни дефект гена остается неизменным.

Долгое время медицинская генетика занималась одной проблемой: установлением генетических основ наследственных заболеваний человека. Были разработаны диагностические тесты для выявления ряда таких заболеваний у новорожденных или плода, и по их результатам проводилось генетическое консультирование семей, относящихся к группе риска. Это позволяло подготовить консультируемых к возможности проявления данного заболевания у их потомков. Кроме того, иногда удавалось смягчить негативные последствия генетического дефекта с помощью медикаментозной терапии, переливания крови или назначения диеты.

Нормальная работа организма обеспечивается функциями множества взаимосвязанных генов, и мутация даже в одном из них может иметь самые разные последствия. Так, мутация, в результате которой изменяется активность того или иного фермента, может приводить к накоплению токсичного субстрата или дефициту соединения, необходимого для нормального функционирования клетки, а мутация в гене, кодирующем структурный белок, – к серьезным нарушениям на уровне клеток, тканей или органов. Кроме того, мутация в гене, экспрессирующемся в одной ткани, может сказаться самым серьезным образом на совсем другой ткани и привести к появлению множества симптомов. Например, мутация в гене печеночного фермента фенилаланиндегидроксилазы, в результате которой блокируется превращение фенилаланина в тирозин, оказывает серьезное влияние на нервную систему. У индивидуума, гомозиготного по дефектному гену, этот фермент не вырабатывается вообще или вырабатывается в очень небольших количествах; это приводит к повышению уровня эндогенного фенилаланина в крови, к неправильному формированию миелиновой оболочки вокруг аксонов нервных клеток центральной нервной системы и как следствие – к тяжелой умственной отсталости. Это врожденное заболевание, называемое фенилкетонурией, встречается у европеоидов с частотой 1 на 10 000 новорожденных. В каждой ткани организма экспрессируется свой набор из всей совокупности генов, но есть мутации, которые приводят к болезням, затрагивающим буквально все органы и ткани: мышцы, глаза, печень, кости, почки, сердце, нервную систему, кожу, мозг, желудок, кишечник, систему кроветворения.

4

Конечной целью медико-генетических исследований является создание методов лечения всех наследственных заболеваний. В таблице 1 перечислены продукты некоторых генов, коротко описаны симптомы заболеваний, которые обусловливаются мутациями в этих генах, указаны способы их лечения. Наследственные заболевания имеют сложные клинические проявления, и их лечение носит во многом симптоматический характер. Некоторые нарушения метаболизма корректируют назначением специальной диеты, что приводит к снижению уровня токсичных веществ в организме, накопление которых обусловливается мутациями в определенных генах. Так, при фенилкетонурии, которую выявляют у новорожденных с помощью специфического биохимического анализа крови, назначают безаланиновую диету. Для облегчения симптомов наследственных заболеваний, связанных с дефектом определенного белка, вводят внутривенно его функциональную форму, не вызывающую иммунной реакции. Такую «заместительную» терапию используют, например, для лечения гемофилии, тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID, от англ. severe combined immunodeficiency) и болезни Гоше. Иногда для компенсации каких-то утраченных функций проводят трансплантацию костного мозга или других органов. К сожалению, нередко интенсивное лечение многих наследственных болезней начинают проводить только тогда, когда пациент находится в критическом состоянии и удается лишь ненамного продлить его жизнь. Поскольку генетические заболевания часто носят системный характер и постепенно приводят к ослаблению организма, разработка эффективных методов лечения представляет собой непростую задачу. Существующая терапия, как правило, малоэффективна, лишь немногие пациенты доживают до старости и могут иметь детей. В большинстве случаев лечение необходимо проводить многократно, оно очень дорогое и длительное. Поэтому разработка новых видов терапии очень актуальна.

Подходом, альтернативным «классическим» способам лечения, является генная терапия: использование нуклеиновых кислот с целью репарации поврежденной последовательности ДНК или по крайней мере внесения компенсаторного изменения, которое восстановит нормальные физиологические функции клетки. Генная терапия – одно из новых направлений генной медицины, когда нуклеиновые кислоты вводятся в человеческие клетки. Другое направление генной медицины основано на применении нуклеиновых кислот традиционным способом – как обычные лекарства, но в данном случае в роли мишени часто выступает мРНК, копируемая с поврежденного гена, а не белок. Кроме того, использование ДНК-вакцин, экспрессирующих в организме антигены, также относят к генной медицине.

Генная терапия по своей сути представляет собой подход, противоположный созданию животных моделей болезни путем мутагенеза. В последнем случае мутации, эффект от которых напоминает человеческие болезни,

5

сознательно генерируются у животных (с использованием технологии переноса генов), что позволяет анализировать биохимические и физиологические аспекты заболевания и анализировать эффективность действия новых лекарств. Многие из методов генной терапии и используемых при моделировании болезней основаны на одних и тех же принципах, хотя и применяются с разными целями. Некоторые модели болезни можно получать с использованием нуклеиновых кислот и белков, подавляющих экспрессию генов или белковую активность.

После того как были установлены молекулярные основы трансформации бактерий (переноса генов из одного штамма в другой), у ученых появилась надежда, что аналогичный механизм – введение нормальных генов в дефектные соматические клетки – можно будет использовать для лечения наследственных заболеваний человека. Перспективы генной коррекции соматических клеток стали более реальными в 1980-х годах; к этому времени были разработаны методы получения изолированных генов, созданы эукариотические экспрессирующие векторы, стали рутинными эксперименты по переносу генов на мышах. В 1990 г. была предпринята первая попытка применения генотерапии для лечения SCID (табл. 1) у двух девочек (National Institute of Health (NIH), Bethesda, USA). Как известно, к гибели В- и

Т-лимфоцитов и развитию тяжелого иммунодефицита приводит токсическое действие аденозина и дезоксиаденозина, уровень которых в крови повышается при дефекте аденозиндезаминазы (АДА). Для терапии использовался следующий подход. Клонированную кДНК АДА ввели в лимфоциты, полученные от каждой из пациенток. Введение нуклеиновой кислоты осуществляли с помощью ретровирусного вектора. Модифицированные клетки, синтезирующие АДА, культивировали и в течение двух лет с определенной периодичностью вводили девочкам. Через четыре года после начала лечения у обеих пациенток наблюдалась экспрессия гена АДА и отмечалось облегчение симптомов SCID. Однако истинная причина улучшения осталась не совсем ясной: был ли это эффект заместительной терапии (внутривенного введения защищенной формы АДА – полиэтиленгликоль-АДА) или собственно генной терапии. Бесспорно одно: этот опыт показал безопасность генной терапии. Сходные результаты были получены и для других пациентов с SCID, одновременно получавших оба вида лечения. Исследования были продолжены на большем числе больных.

6

Таблица 1

Применяемые в настоящее время методы лечения некоторых моногенных заболеваний человека

7

8

В самом общем смысле под генной терапией соматических клеток человека понимают коррекцию специфического наследственного заболевания путем введения в клетку-мишень функционального экспрессирующегося гена. Однако за этим простым определением скрывается целый ряд проблем. Например, как получить доступ к клеткам, предназначенным для коррекции? Как осуществить доставку терапевтического гена? Какая доля кле- ток-мишеней должна получить такой ген, чтобы болезнь отступила? Необходим ли точный контроль транскрипции введенного гена для обеспечения ее эффективности? Не вызовет ли избыточная экспрессия введенного гена побочных эффектов? Будут ли модифицированные клетки поддерживаться бесконечно или потребуются повторные введения?

Хотя генная терапия соматических клеток делает только свои первые шаги, на ряд вопросов, касающихся некоторых наследственных заболеваний, уже получены ответы. Появляются все новые подходы к генной терапии соматических клеток, которые можно разделить на две большие категории: генная терапия in vivo и ex vivo. Разрабатывают и специфические лекарственные препараты на основе нуклеиновых кислот: антисмысловые олигонуклеотиды; РНК-ферменты, модифицированные с помощью генной инженерии; олигонуклеотиды, корректирующие генные мутации in vivo.

Принципы генной терапии

Генная терапия – новая область современной биомедицины, основанная на введении в организм больного рекомбинантных генетических конструкций с лечебной целью. При данном терапевтическом подходе клетки пациента генетически модифицируются с целью облегчения течения болезни.

Генная терапия предполагает введение последовательностей ДНК в клетки-мишени. Она проводится либо с целью коррекции наследственной патологии, возникшей вследствие генетического дефекта, либо для придания этим клеткам новых функций, способствующих устранению патологических процессов. В первом случае в организм больного вводят нормально работающий гомолог дефектного гена. В другом случае вводят гены, обладающие условным цитотоксическим эффектом или способствующие формированию выраженного иммунного ответа. Данный метод применяют при лечении опухолей или инфекций. Мишенями для таких генов служат пораженные ткани, иммунные клетки, специфическим образом проникающие в эти ткани, либо предварительно трансформированные in vitro другие клетки. Таким образом, объектом генетической трансфекции могут служить самые разные соматические клетки, как несущие дефектный ген, так и нормальные клетки, приобретающие терапевтические свойства после трансфекции, в зависимости от характера заболевания и предполагаемого генотерапевтического подхода.

9

Классификация методов генной терапии

1) по типу клеток-мишеней:

•соматическая

•фетальная

Существует важное различие между соматической генной терапией, когда модификации вводятся в соматические клетки и ограничены организмом пациента, и зародышевой генной терапией, когда модификации вводятся в клетки, дающие гаметы, и, таким образом, могут передаваться другим поколениям. В настоящее время правовые основы имеет только соматическая генная терапия. Хотя могут существовать неопровержимые аргументы в пользу применения зародышевой генной терапии при некоторых исключительных обстоятельствах (например, когда родитель уверен, что передал своему потомку мутацию, вызывающую болезнь), сама процедура повсеместно запрещена по этическим соображениям.

2) по цели воздействия:

•позитивная (компенсация экспресcии гена)

•негативная (подавление функций гена)

Известно несколько методов соматической генной терапии, и в зависимости от природы болезни выбирают наиболее подходящий (рис. 1):

–Добавление гена. Этот метод генной терапии используется для лечения наследственных болезней, вызываемых потерей продукта функционального гена. Задача терапии – добавить в геном функциональную копию потерянного или мутированного гена и экспрессировать этот ген на достаточном уровне, чтобы восполнить отсутствующий белок. Метод применим лишь в том случае, если последствия болезни обратимы.

–Ингибирование гена. Этот метод генной терапии пригоден для лечения инфекционных и наследственных заболеваний, рака, если они вызваны неадекватной активностью гена (активность гена чрезмерна). Задача терапии – введение нового гена, продукт которого ингибирует экспрессию патогенного или поврежденного гена или подавляет активность продукта.

–Заместительная генная терапия. Этот метод генной терапии приго-

ден для лечения только наследственных заболеваний (ни в коем случае нельзя использовать в случае инфекционных болезней или рака), но может быть использован для лечения болезней, характеризующихся как потерей, так и приобретением функции гена. Задача – ввести нормальную функционирующую копию дефектного целевого гена, а затем заставить экзогенную ДНК рекомбинировать с целевым геном с целью замещения последнего. Потенциально это самый простой путь исправления генетических дефектов,

10