Биомедицина теория

ническому применению. К примеру, британская компания ReNeuron исследует возможности использования фетальных стволовых клеток для терапии инсульта. Эти клетки уже начали дифференцировку, и, следовательно, каждая из них, во-первых, может пройти только ограниченное число делений, и, во-вторых, дать начало не любым, а достаточно определенным видам специализированных клеток. Этот факт делает их клиническое применение более безопасным. Так, из клеток фетальной печени могут развиться специализированные клетки печени и кроветворные клетки. Из фетальной нервной ткани, соответственно, развиваются более специализированные нервные клетки и т.д.

Гемопоэтические стволовые клетки

Общая характеристика

Гемопоэтические стволовые клетки – мультипотентные стволовые клетки, дающие начало всем клеткам крови миелоидного (моноциты, макрофаги, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, эритроциты, мегакариоциты и тромбоциты, дендритные клетки) и лимфоидного рядов (Т-лимфоциты, В-лимфоциты и естественные киллеры). Потенциал образования клеточной массы у ГСК огромен – стволовые клетки костного мозга ежедневно продуцируют 1011 клеток, составляющих форменные элементы периферической крови. Сам факт существования ГСК был установлен в 1961 году в экспериментах по восстановлению гемопоэза у мышей, получивших смертельную дозу радиоактивного облучения, разрушающего стволовые клетки костного мозга. После трансплантации клеток сингенного костного мозга таким летально облученным животным в селезенке реципиентов были обнаружены дискретные очаги кроветворения, источник которых – единичные клоногенные клетки-предшественники.

Затем была доказана способность ГСК к самоподдержанию, обеспечивающая функцию кроветворения в процессе онтогенеза. В процессе эмбрионального развития ГСК отличаются высокой миграционной активностью, необходимой для их перемещения в зоны закладки кроветворных органов. Это свойство ГСК сохраняют и в онтогенезе – за счет их постоянной миграции происходит перманентное обновление пула иммунокомпетентных клеток. Способность ГСК к миграции, проникновению сквозь гистогематические барьеры, имплантации в тканях и клоногенному росту послужила основой для трансплантации клеток костного мозга при целом ряде заболеваний, связанных с патологией системы кроветворения.

Развитие ГCK происходит следующим образом. В желточном мешке у эмбриона начинается гемопоэз, т. е. процесс образования, развития и созревания клеток крови, по мере развития эта функция переходит к печени плода, а затем к костному мозгу, в котором она сосредоточена в течение

71

всей жизни. ГCK дает начало элементам крови, заполняет другие гемо- и лимфопоэтические органы и, самовоспроизводясь, превращается в новые CK. Она плюрипотентна. Одним из наиболее важных примеров взаимодействия гемопоэтических клеток является способность трансплантированных CK возвращаться в костный мозг. Такой процесс носит название «хоуминг». Благодаря росту и самообновлению CK способны воспроизводиться. Основным маркером гемопоэтических CK является CD34 – белок, присутствующий на их поверхности. Иммунофенотипически ГСК человека характеризуются как CD34+DR-клетки, способные мигрировать в кровеносное русло и заселять органы иммунной системы или же репопулировать строму костного мозга. Нужно четко представлять, что ГСК не являются наиболее незрелыми клетками костного мозга, а происходят от предшественников, к которым относят дормантные (резервные) фибробластоподобные СD34-негативные клетки. Установлено, что клетки с фенотипом CD34 способны к выходу в общий кровоток, где меняют свой фенотип на CD34+, но при обратной миграции в костный мозг под влиянием микроокружения вновь становятся СD34-негативными стволовыми клеточными элементами. В состоянии покоя СD34--клетки не реагируют на паракринные регуляторные сигналы стромы (факторы роста, цитокины). Однако в ситуациях, требующих усиления интенсивности кроветворения, стволовые клетки с фенотипом CD34 отвечают на дифференцировочные сигналы образованием как гемопоэтических, так и мезенхимальных клеток-предшественников. Кроветворение осуществляется при непосредственном контакте ГСК с клеточными элементами стромы костного мозга, представленной сложной сетью макрофагов, ретикулярных эндотелиальных клеток, остеобластов, стромальных фибробластов и внеклеточным матриксом. Стромальная основа костного мозга – не всего лишь матрица или «скелет» для гемопоэтической ткани, она осуществляет тонкую регуляцию гемопоэза за счет паракринных регуляторных сигналов факторов роста, цитокинов и хемокинов, а также обеспечивает адгезивные взаимодействия, необходимые для образования клеток крови.

Таким образом, в основе постоянно обновляющейся системы гемопоэза лежит полипотентная (с точки зрения кроветворения) ГСК, способная к длительному самоподдержанию. В процессе коммитирования (специализации) ГСК подвергаются первичной дифференцировке и образуют клоны клеток, отличающихся по цито-, морфологическим и иммунофенотипическим характеристикам. Последовательное формирование примитивных и коммитированных клеток-предшественников завершается образованием морфологически идентифицируемых клетокродоначальниц различных гемопоэтических линий. Результатом последующих этапов сложного многостадийного процесса кроветворения является дозревание клеток и выход в периферическую кровь зрелых

72

форменных элементов – эритроцитов, лейкоцитов, лимфоцитов и тромбоцитов.

Гемопоэтические стволовые клетки считаются наиболее изученным стволовым источником, что во многом связано с их использованием в клинике при трансплантации костного мозга. На первый взгляд, об этих клетках известно достаточно много. В какой-то мере это соответствует действительности, поскольку промежуточные и зрелые потомки ГСК – наиболее доступные клеточные элементы, каждый из которых (эритроциты, лейкоциты, лимфоциты, моноциты/макрофаги и тромбоциты) тщательно изучался на всех уровнях – от световой до электронной микроскопии, от биохимических и иммунофенотипических характеристик до идентификации методами ПЦР-анализа. Однако проведенный мониторинг морфологических, ультраструктурных, биохимических, иммунофенотипических, биофизических и геномных параметров ГСК так и не позволил получить ответы на многие проблемные вопросы, решение которых необходимо для развития клеточной трансплантологии. До сих пор не установлены механизмы стабилизации ГСК в дормантном состоянии, их активации, выхода на этап симметричного или асимметричного деления, а главное – коммитирования к образованию настолько функционально разных форменных элементов крови, как эритроциты, лейкоциты, лимфоциты и тромбоциты.

ГСК являются неоднородной популяцией. Различают три субпопуляции ГСК, в соответствии с пропорциональным отношением лимфоидного потомства к миелоидному (Л/M). У миелоидно ориентированных ГСК низкое Л/М соотношение (0<Л/М<3), у лимфоидно ориентированных – высокое (>10). Третья группа состоит из «сбалансированных» ГСК, для которых 3 ≤ Л/M ≤ 10. В настоящее время активно исследуются свойства различных групп ГСК, однако промежуточные результаты показывают, что только миелоидно ориентированные и «сбалансированные» ГСК способны к продолжительному самовоспроизведению. Кроме того, эксперименты по трансплантации показали, что каждая группа ГСК преимущественно воссоздаёт свой тип клеток крови, что позволяет предположить наличие наследуемой эпигенетической программы для каждой субпопуляции.

Популяция ГСК формируется во время эмбриогенеза, то есть эмбрионального развития. Доказано, что у млекопитающих первые ГСК обнаруживаются в областях мезодермы, называемых аорта, гонада и мезонефрос, до формирования костного мозга популяция расширяется в фетальной печени. Такие исследования способствуют пониманию механизмов, ответственных за генезис (формирование) и расширение популяции ГСК, и, соответственно, открытию биологических и химических агентов (действующих веществ), которые в конечном счёте могут быть использованы для культивации ГСК in vitro.

73

Основные источники гемопоэтических стволовых клеток

Основным источником ГСК является костный мозг. Этот источник и сегодня наиболее широко используется в трансплантологии. ГСК располагаются в костном мозге у взрослых, включая бедренные кости, рёбра, мобилизации грудины и другие кости. Клетки могут быть получены непосредственно из бедра при помощи иглы и шприца, или из крови, после предварительной обработки цитокинами, включая G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), способствующий высвобождению клеток из костного мозга. Хорошо подготовленная процедура сбора таких клеток, как правило, совершенно безопасна. Клетки, полученные от самого пациента, называют аутологичными (собственными) стволовыми клетками. Их активность и качество не сильно отличается от клеток, полученных из других источников. В то же время отсутствуют юридические ограничения для их применения, нет этических трений. При условии профессиональной подготовки, применение таких клеток в клинической медицине считается безопасным: они не отторгаются, не обладают онкогенными свойствами, нет риска заражения опасными инфекциями при трансплантации.

Вторым источником получения ГСК является периферическая кровь пациента после проведения процедур стимуляции костного мозга, так называемыми колониестимулирующими ростовыми факторами.

Третьим, наиболее важным и перспективным источником ГСК является пуповинная кровь. Концентрация ГСК в пуповинной крови в десять раз выше, чем в костном мозге. Кроме того, у этого источника есть ряд преимуществ. Во-первых, возраст. Пуповинная кровь собирается на самом раннем этапе жизни организма. Сам сбор пуповинной крови совершенно прост и не вызывает неприятных реакций. Этот сбор занимает всего минуту. Сбор же костного мозга проходит под общим наркозом и длится несколько часов. ГСК пуповинной крови максимально активны, поскольку не подвергались негативному воздействию внешней среды (инфекционные заболевания, нездоровое питание и т. д.). ГСК пуповинной крови способны создать большую клеточную популяцию в короткий срок. Во-вторых, совместимость. Клетки из пуповинной крови редко, в отличие от их «собратьев» – костного мозга и периферической крови, отторгаются организмом, вызывая осложнения. Использование аутологичного материала, то есть собственной пуповинной крови гарантирует 100%-ю совместимость. Совместимость с братьями и сёстрами составляет до 25 %, как правило, возможно также использование пуповинной крови ребёнка для лечения других близких родственников. Для сравнения, вероятность нахождения подходящего донора стволовых клеток – от 1 : 1000 до

1 : 1 000 000.

ГСК из пуповинной крови помещаются в криобанк на хранение, в дальнейшем могут использоваться для восстановления многих органов и

74

тканей пациента, а также для лечения различных заболеваний, в первую очередь гематологических и онкологических. Однако эффективное применение этих стволовых клеток, как правило, возможно только однократно для самого ребёнка в возрасте до 12–14 лет. По мере взросления, объема заготовленных СК становится недостаточно для полноценного клинического эффекта.

По статистике лишь каждый 4-й образец пуповинной крови содержит CK в количестве, достаточном для трансплантации взрослому пациенту. Поэтому существуют ограничения применения CK пуповинной крови. Ученые и практические врачи пытаются найти выходы из этого положения. Проводятся исследования по комбинированию нескольких совместимых образцов.

Еще одним методом, способным существенно повысить число годных для трансплантации образцов пуповинной крови, является перфузия плаценты, т. е. промывка сосудов биологически активными веществами, физиологическими растворами крови или др. жидкостей.

Гемопоэтические стволовые клетки в онкогематологии

В механизмах прогрессирования миелодиспластических синдромов важную роль играет феномен метилирования цитозиновых остатков ДНК. Гиперметилирование ДНК блокирует транскрипцию целого ряда генов, в том числе ингибитора циклинзависимых киназ pl5INK4B. При рефрактерных анемиях гиперметилирование ДНК с наличием метилированного pl51NK4B встречается в 17 % случаев, у больных с рефрактерной анемией с избытком бластов – в 48 % случаев, а при трансформации в острый миелобластный лейкоз – у 89 % пациентов.

С современных позиций, лечение миелодиспластических состояний должно быть основано на разработке комплексных терапевтических алгоритмов, предусматривающих возможности трансплантации аллогенных ГСК. Под трансплантацией ГСК следует понимать переливание пациенту суспензии выделенных и максимально очищенных от клеточных примесей ГСК с целью восстановления гемопоэза после проведения химио- и/или лучевой терапии в максимально переносимых (миелоаблативных) дозах. В зависимости от донора трансплантируемых клеток, выделяют следующие виды трансплантации ГСК: аллогенную – пересадка клеток от родственного или неродственного донора, полностью или частично совместимого с реципиентом по HLA-системе; аутологичную – реинфузия пациенту его собственных, предварительно сохраненных клеток; сингенную, при которой донором является гомозиготный близнец, генетически абсолютно идентичный реципиенту. В зависимости от источника получения ГСК, различают трансплантацию костного мозга, пересадку мобилизированных в

75

периферическую кровь ГСК, трансплантацию ГСК пуповинной крови и гемопоэтических клеток эмбриональной печени.

Таким образом, трансплантация ГСК применяется как с целью лечения злокачественных новообразований, так и в терапии заболеваний крови, в том числе и миелодиспластических состояний. Патогенетически миелодиспластические состояния представляют собой гетерогенную группу клональных заболеваний крови, характеризующихся периферической цитопенией (дефицитом одного или нескольких различных видов клеток крови), нормоили гиперклеточностью, реже – гипоклеточностью костного мозга, а также дисплазией клеток крови и костного мозга. В основе развития миелодиспластических состояний лежат приобретенные генетические дефекты стволовых кроветворных клеток, поэтому все варианты миелодиспластических синдромов с различной вероятностью трансформируются в острые миелоидные лейкозы.

Среди различных методов лечения миелодиспластических состояний поддерживающая терапия, химиотерапия и трансплантация стволовых кроветворных клеток получили статус условно стандартных. Терапевтические подходы с применением иммунодепрессантов, индукторов дифференцировки, антицитокинов, цитопротекторов, ингибиторов топоизомеразы I и моноклональных антител, а также их различные комбинации пока относятся к альтернативным методам лечения.

Среди факторов, определяющих выбор тактики лечения, наиболее важными являются возраст и соматический статус больного, прогностическая группа, вариант миелодиспластического состояния, а также наличие родственного гистосовместимого донора ГСК.

Несмотря на разработку многочисленных альтернативных методов терапии, трансплантация аллогенных ГСК остается единственным способом радикального излечения миелодиспластических состояний. При наличии гистосовместимого донора этот способ является терапией выбора у пациентов в возрасте до 50 лет. По данным нескольких крупных исследований, после аллотрансплантации ГСК длительная безрецидивная выживаемость достигается у 40 % больных. Гораздо лучшие результаты после аллотрансплантации ГСК наблюдаются у молодых больных с коротким анамнезом заболевания, особенно в случае пересадки стволовых клеток, полученных от родных братьев и сестер, при количестве бластных клеток у реципиента менее 10 % и благоприятной цитогенетике.

При миелодиспластических состояниях имеется определенный прогресс в области аллотрансплантации ГСК от неродственных HLAсовместимых доноров. В частности, результаты десятилетней работы Национальной программы донорства костного мозга США (510 больных с миелодиспластическими состояниями при среднем возрасте 38 лет) свидетельствуют о 29 % двухлетней безрецидивной выживаемости при

76

относительно низкой вероятности рецидива, не превышающей 14 % (Castro-Malaspina et al., 2002). Тем не менее, смертность, обусловленная процедурой аллотрансплантации ГСК от неродственного донора, чрезвычайно высока и достигает в течение 2 лет 54 %. Подобные результаты представлены в Европейском исследовании (118 больных с миелодиспластическими синдромами, средний возраст – 24 года, двухлетняя безрецидивная выживаемость – 28 %, частота рецидива – 35 %, смертность – 58 %).

Реакция «трансплантат против хозяина», а, соответственно, и реакция «трансплантат против лейкоза» отсутствуют при пересадке аутологических ГСК.

В последние годы все больше исследователей предпочитают выполнять трансплантацию стволовых гемопоэтических клеток вместо трансплантации костного мозга. Общепризнанными стали такие преимущества трансплантации мобилизированных в периферическую кровь ГСК перед трансплантацией костного мозга, как низкая травматичность процедуры забора материала, более низкая вероятность переноса злокачественных клеток с трансплантатом при аутотрансплантации, меньшая летальность, более благоприятное течение раннего посттрансплантационного периода, а также возможность длительного хранения материала для трансплантации.

Расширенный ретроспективный анализ причин ранней летальности позволил выделить и противопоказания к аллогенной трансплантации ГСК. Аллотрансплантацию ГСК не следует проводить при положительных тестах у реципиента или донора на цитомегаловирусную инфекцию (без превентивного лечения), у пациентов с острой лучевой болезнью, при подозрении или наличии у пациента микозной инфекции (без проведения системной ранней профилактики фунгицидными препаратами), больным с гемобластозами после длительного лечения цитостатиками (по причине высокой вероятности внезапной остановки сердца и развития полиорганной недостаточности), при пересадке от HLA-неидентичных доноров (без профилактики острой реакции «трансплантат против хозяина» циклоспорином А), пациентам с хроническим вирусным гепатитом С (в связи с высоким риском развития веноокклюзионной болезни печени). Для профилактики отторжения трансплантата и предупреждения развития острой реакции «трансплантат против хозяина» при проведении аллотрансплантации ГСК дополнительно вводят антилимфоцитарный и антитимический глобулины, усиливающие иммуносупрессию. Эффективной может оказаться иммунотерапия (IL-2, интерферон, трансфузия донорских лимфоцитов).

Наибольшее распространение трансплантация ГСК получила в онкогематологии, где ее применение для лечения различных гемобластозов

77

имеет ряд особенностей. Максимальная эффективность трансплантации ГСК реципиентам с острым миелобластным лейкозом отмечена при условии ее проведения в период первой полной клинико-гематологической ремиссии. При этом четырехлетняя безрецидивная выживаемость больных с острым миелобластным лейкозом после аллоили аутотрансплантации ГСК, достигает соответственно 55 и 48 %.

Показания к трансплантации ГСК при злокачественных лимфомах не отработаны вследствие гетерогенности их гистологических форм и достаточно высокой эффективности стандартных или высокодозных протоколов полихимиотерапии.

Гемопоэтические стволовые клетки и генотерапия

Вконце 2000 года в мировой научной литературе появились публикации о результатах использования стволовых гемопоэтических клеток костного мозга с целью лечения ряда негематологических заболеваний.

Всвязи с этим следует помнить, что трансплантация ГСК может повлечь за собой развитие серьезных осложнений, нередко приводящих к летальному исходу. В раннем (до ста дней после трансплантации) периоде к ним относятся инфекционные осложнения, острая реакция «трансплантат против хозяина», реакция неприживления ГСК донора, веноокклюзионная болезнь печени и обусловленное токсичностью режима кондиционирования поражение быстрорегенерирующих тканей (костного мозга, кожи, эндотелия и эпителиальных клеток). Среди осложнений позднего посттрансплантационного периода необходимо отметить хроническую реакцию «трансплантат против хозяина», задержку роста у детей, нарушение функции репродуктивной системы и щитовидной железы, а также поражение глаз

Предпосылками к использованию ГСК в генной терапии послужили экспериментальные данные о способности стволовых кроветворных клеток приживляться в организме реципиента. В частности, из СD34-позитивных клеток эндотелия дорзальной аорты зародыша мыши были получены две линии эндотелиальных клеток, одна из которых (DAS 104-8) индуцировала дифференцировку ГСК в эритроидном, миелоидном и лимфоидном направлениях. Другая линия (DAS 104-4) была менее эффективна в этом отношении, но способствовала поддержанию в культуре клеточных

элементов с фенотипическими характеристиками стволовых клеток (Lin CD34+Sca+c-kit+). Выращенные на таком подслое ГСК фетальной печени при трансплантации активно репопулировали костный мозг облученного реципиента.

Впринципе, это решает вопрос транспорта генетической информации в организм больного, однако для успешного практического развития генной

78

терапии прежде всего необходимо решить проблему эффективного переноса терапевтического гена в геном стволовых клеток, достаточно надежно защищенный от внешних воздействий, в том числе и от включений посторонней генетической информации. Такой известный метод транспорта генов, как ДНК-связанный перенос, осуществляется путем трансфекции: эндоцитоза в клетки за счет преципитации с кальция фосфатом, прямой микроинъекции ДНК в клетки, липофекции, при которой ДНК заключается в липофильные везикулы, которые сливаются с клеточной мембраной и многих других методов. Уже сама многочисленность предложенных методов говорит об их низкой эффективности, которая составляет 0,01–10 %.

Проблема повышения эффективности переноса терапевтического гена в эксперименте частично решается с помощью вирусов. В частности, на мышиных моделях некоторые вирусные векторы обеспечивают 100 % эффективность переноса ДНК. Векторы, используемые для переноса генов, представляют собой вирусы, не способные к репликации. Первые исследования в области генотерапии были направлены на определение степени безопасности применения вирусных векторов с целью переноса генов пациентам. Перенос гена in vitro заключается в транспорте генетического материала в клетки пациента, находящиеся в культуре. Далее генетически модифицированные клетки вводятся обратно реципиенту. Этот подход наиболее приемлем и удобен для переноса генов в клетки костного мозга, так как уже существуют хорошо отработанные методы по переносу кроветворных клеток из организма в культуру и обратно. Тем не менее, в настоящий момент эффективность переноса генов в клетки крупных млекопитающих очень мала (0,1–1 %). Во многих лабораториях мира разрабатываются различные подходы к повышению эффективности переноса генов в клетки человека.

В настоящее время более 60 % существующих клинических протоколов по генотерапии используют ретровирусные векторы. Ретровирусы – это РНК-содержащие вирусы размером около 10 kb. Ретровирусный геном включает в себя 3 гена (gag, pol и env), белковые продукты которых необходимы для репликации и формирования вирусных частиц: gag кодирует структурный белок; pol несет в себе последовательность для синтеза обратной транскриптазы, env кодирует белок оболочки, который распознает рецепторы на поверхности клетки и способствует проникновению вируса в клетку-мишень.

Наиболее часто в генотерапии применяется вирус Молони, вызывающий лейкоз у мышей.

Герпес-вирус обладает несколькими биологическими свойствами, которые, в принципе, позволяют использовать его в генотерапии для переноса терапевтических генов в нейроны. Установлено, что герпес-вирус способен инфицировать нейроны сенсорных ганглиев и пребывать там в пожизненном

79

латентном состоянии, в котором вирусный геном не интегрирован в геном клетки, литические гены не функционируют и жизнедеятельность клеткихозяина не нарушается. При этом, несмотря на латентное состояние вируса, экспрессируются транскрипты, ассоциированные с латентностью (LATs), регулируемые элементами нейронспецифического латентно-активного промотора – LAP, что и может быть использовано для экспрессии трансгенов, локализованных в латентном вирусе.

В последнее время разрабатываются векторы на основе лентивируса, а точнее ВИЧ. Эти векторы имеют существенное преимущество перед векторами, основанными на вирусе Молони, благодаря способности интегрироваться в геном не делящихся клеток. К сожалению, этот метод пока еще не очень эффективен и нуждается в дальнейшей доработке.

Надо заметить, что генотерапия с использованием стволовых и соматических клеток человека находится в самом начале своего развития. Генотерапия может стать безопасным и эффективным методом устранения тяжелых наследственных дефектов. Помимо генетических заболеваний, генотерапия может быть применена при опухолях и тяжелых вирусных инфекциях.

Большое значение для генотерапии имеет и возможность наращивания стволовой клеточной массы ex vivo, в первую очередь, ГСК. По данным некоторых авторов, увеличения количества ГСК можно достичь путем их выращивания в культуре, содержащей эндотелиоциты и гемопоэтические факторы роста.

Таким образом, ГСК вполне могут оказаться оптимальным инструментом для транспорта генетической информации в организм больного, однако до проведения первых клинических испытаний необходимо тщательно отработать технику введения терапевтического гена в дормантную стволовую клетку и его надежную длительную активацию в микроокружении тканей реципиента.

Мезенхимальные стволовые клетки

Среди регионарных стволовых клеток особое место занимают мезенхимальные стволовые клетки, производные которых составляют стромальную матрицу всех органов и тканей организма человека.

Основы научных представлений о CK костного мозга заложили отечественные ученые Александр Яковлевич Фриденштейн, работавший в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, и Иосиф Львович Чертков, работавший в Гематологическом центре РАМН. Гематолог Фриденштейн был первым, кто обнаружил в костном мозге еще один вид более пластичных клеток, которые он назвал мезенхимальными. Эти клетки обладают возможностью превращаться в любой вид ткани (костную, хрящевую и др.), т. е. могут дать начало почти всем типам

80