Биомедицина теория

Было испытано более 500 протоколов генной терапии, более половины из которых предназначены для лечения рака (см. базы данных NIH по испытаниям генной терапии: www.od.nih.gov/oba/rac/clinicaltrial.htm).

Ниже мы рассмотрим ряд исследований, иллюстрирующих применение различных типов генной терапии, а также демонстрирующих связанные с этим возможные риски. Следует подчеркнуть, что при использовании генной терапии остается некоторый риск развития непредсказуемого результата.

Таблица 4

Некоторые заболевания, генная терапия которых проходит испытания с 1990 г.

41

Возможности и перспективы применения методов генной терапии в медицине

Среди заболеваний, для лечения которых могут быть использованы методы генной терапии:

•муковисцидоз (кистозный фиброз поджелудочной железы) – перенос гена МТР (муковисцидозный трансмембранный регулятор) с помощью аденовирусного вектора и липосом.

•мышечная дистрофия Дюшена – введение нормальных копий кДНК гена дистрофина с помощью ретровирусных векторов.

•рестеноз (повторное сужение просвета артерии после ангиопластики)

–введение в сосуд гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в виде плазмидной ДНК.

•ряд других заболеваний, приведенных в таблицах 5 и 6.

Таблица 5

Причины возникновения некоторых заболеваний и клетки-мишени для возможной терапии

Некоторые технологии генной терапии, находящиеся на III фазе клинических испытаний

Генная терапия глиобластомы головного мозга

После резекции в ложе опухоли вносятся мышиные клетки РА317, продуцирующие ретровирусный вектор, экспрессирующий ген тимидинкиназы вируса простого герпеса.

Через неделю больным вводится препарат ганцикловир, который после фосфорилирования in situ обрывает синтез ДНК в быстроделящихся клетках.

Genetic Therapy, Inc./Novartis

42

Реализуемые механизмы:

•прямой эффект фосфорилированного ганцикловира;

•«bystander effect» – гибель соседних опухолевых клеток за счет проникновения токсического продукта (трифосфат ганцикловира);

•локальное воспаление как результат введения мышиных клеток;

•системный иммунный ответ.

Таблица 6

Заболевания, при которых перспективным считается проведение генной терапии

Генная терапия остеосаркомы (ESCCHN) (2 протокола)

Частота встречаемости – 40 000 случаев в год (США).

Предпосылки – более 50 % пациентов имеют повышенный уровень экспрессии мутантной формы р53.

Генотерапевтический агент – фактор супрессии опухоли (кДНК р53). Вектор – аденовирус тип 5.

Способ введения – прямая инъекция в опухоль. Увеличение выживаемости в 2 раза.

Генная терапия метастатической меланомы (иммунотерапия)

Генотерапевтический агент – HLA-B7/Beta-2 Microglobulin cDNA.

Презентация антигенов MHC класса I на поверхности опухолевой клетки после экспрессии HLA-B7/Beta-2 Microglobulin cDNA.

Вектор – плазмидная ДНК в комплексе с катионными липосомами и

DMRIE-DOPE.

43

Способ введения – прямая инъекция в опухоль.

31 % пациентов не имели возврата опухоли в течение 6 лет.

Кроме того, в последнее время постоянно появляются новые данные о возможности использования методов генной терапии в лечении онкологических, сердечно-сосудистых, инфекционных (в том числе вызванных вирусами гриппа, ВИЧ, вирусом оспы и др.).

Терапия добавления гена in vivo: муковисцидоз

Около 10 % методов генной терапии предназначены для лечения редких заболеваний с менделевским типом наследования. Это связано с тем, что дефекты в одном гене могут корректироваться самым простым путем, т. е. моногенной терапией. Муковисцидоз (кистозный фиброз, КФ) – самое распространенное менделевское (моногенное) заболевание среди представителей европеоидной расы, встречающееся 1 раз на каждые 2000 новорожденных. Дефект в гене CFTR приводит к потере хлоридного канала в мембране. Проявление болезни наблюдается в основном в дыхательной системе и поджелудочной железе, где дисбаланс ионов хлора вызывает появление густой слизи. В легких это вызывает затруднения в дыхании и способствует инфекциям, в то время как в поджелудочной железе слизь блокирует экскрецию пищеварительных ферментов, что приводит к нарушениям пищеварения. Введение функционирующего гена CFTR должно помочь ликвидировать эти эффекты.

Первоначальные испытания генной терапии КФ включали использование аденовирусных векторов, которые естественным образом инфицируют клетки верхних дыхательных путей. Векторы доставлялись с использованием аэрозольных ингаляторов, и у некоторых пациентов высокие дозы вектора вызывали воспалительные реакции. Испытания, проведенные совсем недавно, включали более безопасные векторы, основанные на аденоассоциированных вирусах, или невирусную доставку генов липосомами. Несмотря на то, что удалось осуществить перенос гена и была достигнута ограниченная экспрессия, результаты в целом оказались обескураживающими. Главная причина – в неспособности векторов-переносчиков генов проникать через слизь, покрывающую легкие больных КФ.

Терапия добавления гена ex vivo: тяжелый комбинированный иммунодефицит (SCID)

Первые испытания генной терапии начались в 1990 г. и проходили с участием четырехлетней девочки, страдающей тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID). Болезнь характеризуется отсутствием функциональных лимфоцитов (В-клеток и Т-клеток), что приводит к полной неспособности бороться с инфекцией. Тяжелый комбинированный иммунодефицит может вызываться рядом дефектов, но в данном конкретном случае нефункциональным был ген ADA, кодирующий аденозиндезаминазу. Единственные традиционные методы лечения ADA-

44

SCID предлагают пересадку костного мозга от подходящего донора или регулярные инъекции рекомбинантным ферментом AДA. В отсутствие такого лечения больные дети вынуждены жить в (искусственных) стерильных условиях – «дети под колпаком».

Дефицит AДA был идеальным первым объектом для испытаний методов генной терапии по следующим причинам:

•Патологическое действие болезни обратимо.

•Болезнь – результат потери функции одного гена.

•Уровень AДA широко варьирует в нормальных популяциях, так что жесткий контроль введенного гена не очень важен.

•Ген ADA очень маленький, его легко перестраивать в лабораторных условиях.

•Клетки-мишени для терапии – лимфоциты, они доступны, легко культивируются и могут быть легко возвращены в организм пациента.

•Альтернативные методы лечения очень дорогостоящи и/или опасны. Функциональный ген ADA был введен в ретровирусный вектор и

использовался для трансдукции культивированных Т-лимфоцитов, которые в дальнейшем были введены обратно в организм пациента. Хотя испытания на тот момент были признаны успешными, эффект от лечения оказался кратковременным, и пациент в настоящее время продолжает лечение препаратами фермента AДA. Была начата следующая серия испытаний. В качестве мишеней были использованы клетки костного мозга или клетки крови из пупочного канатика, поскольку эти популяции содержат стволовые клетки, продуцирующие лимфоциты на протяжении всей жизни. Модификация этих стволовых клеток приводила к долговременной продукции небольшого числа AДA-положительных лимфоцитов, но уровни AДA, производимые этими клетками, были очень низкими. Более того, в течение всего периода испытаний клеток продолжалась терапия ферментом AДA, и пока неясно, выжили бы пациенты без этой терапии.

В 2002 г. произошел значительный прорыв в области генной терапии ADA-SCID, явившийся результатом использования метода, называемого

немиелоаблативным кондиционированием, при котором костный мозг больного SCID частично убивают, чтобы дать возможность модифицированным стволовым клеткам размножаться. Другим важным фактором было то, что никого из детей, участвующих в испытаниях, не лечили ферментом AДA. Возможно, отсутствие успеха в предыдущих испытаниях генной терапии могло быть связано с лечением ферментом. Первым пациентом была двухлетняя девочка из Палестины, которая никогда не проходила терапии AДA. Новый метод лечения, судя по всему, до сих пор оказывает благотворное действие на ее состояние, и теперь она живет дома с родителями, а в ее организме вырабатываются антитела, как и у других детей. Девочка заболела ветряной оспой и выздоровела, хотя еще за несколько месяцев до этого безусловно погибла бы.

45

Генная терапия использовалась также для лечения родственной болезни (Х-сцепленного SCID), которая вызывается потерей гамма-цепи рецептора интерлейкина-2. Как и в случае ADA-SCID, был реализован подход ex vivo, при котором ретровирусный вектор, содержащий полноценную копию поврежденного гена IL2RG, был использован для трансдукции культивированных гематопоэтических стволовых клеток, впоследствие снова введенных в организм пациента. Девять из 11 подвергнувшихся лечению пациентов, судя по всему, излечились. Но с момента начала испытаний два из них заболели лейкемией, которая, повидимому, была вызвана активацией онкогена LM02, прилегающего к месту интеграции ретровируса. По этой причине испытания генной терапии, включающие ретровирусную трансдукцию, были приостановлены до получения новых данных о состоянии этих пациентов.

Терапия добавления и ингибирования генов in vivo: рак

Рак – приобретенное генетическое заболевание – характеризуется избыточной пролиферацией клеток. Генная терапия разрабатывается в качестве важной альтернативы обычным методам лечения (радиотерапии, химиотерапии и биотерапии), и более половины всех опробованных протоколов генной терапии предназначены для лечения рака. Стандартная терапия добавления гена, как это обсуждалось в двух предыдущих случаях, может быть использована для замены утраченных генов опухолевых супрессоров с целью восстановить нормальный контроль над клеточным циклом. Однако большинство подходов к лечению рака включают либо ингибирование онкогенов, либо уничтожение раковых клеток. Существует множество различных стратегий (табл. 7).

Таблица 7

Основные подходы в генокоррекции онкологических заболеваний

46

На ранних стадиях испытаний генной терапии рака сами опухолевые клетки не использовались в качестве терапевтической мишени. Вместо этого инфильтрующие опухоль лимфоциты трансформировали с добавочной копией гена фактора некроза опухоли, что делало их еще более эффективными убийцами. Это расширение адаптивной биотерапии, при которой Т-клетки стимулируются ex vivo под действием интерлейкина 2.

Использование ретровирусов в качестве векторов для генной терапии in vivo дает большие преимущества, поскольку эти вирусы могут инфицировать пролиферирующие клетки и, таким образом, являются селективными по отношению к опухолевой ткани. В связи с этим был разработан ряд методов генной терапии, в которых мишенями служили опухолевые клетки. Например, широко используемый метод – введение антиген-продуцирующих генов, которые делают раковые клетки более подверженными атаке со стороны иммунной системы. В то же время, если известен специфический онкоген, участвующий в развитии рака, то может быть разработан подход, при котором мишенью служит продукт этого гена. Однако большинство подходов к генной терапии рака включает направленное уничтожение клеток путем введения генов «самоубийства», которые превращают нетоксическое пролекарство в токсическое производное. Примером служит ген тимидинкиназы из вируса простого герпеса, которая превращает безвредное пролекарство ганцикловир в нуклеотидный аналог, способный включаться в ДНК и блокировать репликацию путем ингибирования ДНК-полимеразы (рис. 11). Здесь пролекарство, аналог нуклеозида гуанозина, фосфорилируется ферментом тимидинкиназой, ген которой может быть введен в раковые клетки в качестве гена «самоубийства». В результате действия клеточных киназ образуется трифосфат указанного аналога, который может включаться в ДНК. Содержащая ганцикловир ДНК менее стабильна, чем нормальная ДНК, и это вызывает остановку ДНК-полимеразного комплекса, что приводит к блокированию репликативной вилки до тех пор, пока не произойдет репарация ДНК. Если репарация невозможна (как в случае присутствия избытка ганцикловира), клетки подвергаются апоптозу.

Рис. 11. Активность ганцикловира

47

Лекарства на основе нуклеиновых кислот

Генная терапия подразумевает введение функциональных генов в клетки человека. Принцип состоит в том, что эти гены, будучи интегрированы в хромосому или находясь в составе эписом, экспрессируются, и продукт гена либо компенсирует первоначальный дефект, либо противодействует ему. Другой подход предполагает использование нуклеиновых кислот в качестве лекарств. В этом случае нуклеиновая кислота выступает не в роли экспрессирующегося гена, а в виде экзогенно вводимой молекулы, которая захватывается клетками и предназначена для того, чтобы препятствовать экспрессии или активности эндогенного гена на уровне ДНК, РНК или белка (табл. 8). Введение этих лекарств осуществляется с использованием рассмотренных ранее невирусных методов переноса генов. Однако в отличие от генной терапии, лекарственное действие нуклеиновых кислот, как ожидается, не будет долговременным. Они могут помочь излечиться от инфекционных болезней или рака, но являются лишь средством симптоматического лечения в случае наследственных заболеваний.

Антисмысловые препараты

Антисмысловые (антисенс) препараты – это короткие олигонуклеотиды (обычно длиной 12–25 нуклеотидов), содержащие последовательность, комплементарную кодирующей цепи гена-мишени. Они могут ингибировать экспрессию поврежденного гена двумя путями. Первый путь включает взаимодействие антисмысловых олигонуклеотидов с ДНК с образованием стабильного триплекса, предотвращающего транскрипцию. Второй путь включает взаимодействие с мРНК с образованием стабильного дуплекса, что ингибирует синтез белка, а также приводит к селективной деградации мРНК-мишени ферментом РНазой Н. Последняя узнает двухцепочечные нуклеиновые кислоты и разрушает входящую в их состав РНК. В случае дуплексов РНК-PH К деградации подвергаются обе цепи, а в случае дуплексов ДНК-РНК разрушается только PH К-цепь. Следовательно, ДНК-олигонуклеотиды – более эффективные терапевтические агенты, так как они могут последовательно взаимодействовать с множеством транскриптов. Несмотря на то что ДНК- и РНК-олигонуклеотиды удобно синтезировать, они подвержены деградации клеточными нуклеазами. Поэтому в настоящее время антисмысловые лекарства представляют собой структурные производные природных нуклеиновых кислот (например, ДНК с модифицированными фосфоротиоатными связями) или синтетические аналоги олигонуклеотидов, содержащие химические связи, устойчивые к клеточным нуклеазам (например, пептидные нуклеиновые кислоты, в которых основания прикреплены к синтетическому пептидному остову, и аналогичные

48

соединения с найлоновым или карбазатным остовом). Вообще же, действие любого антисмыслового олигонуклеотида непредсказуемо и должно устанавливаться эмпирически. При использовании синтетических молекул может также проявляться неспецифический токсический эффект. Чрезвычайно эффективны устойчивые к действию нуклеаз морфолиноолигонуклеотиды (производные олигорибонуклеотидов), которые решают многие из указанных проблем. Первое одобренное антисмысловое лекарство фомивирсен (витравен) – ДНК-олигонуклеотид с фосфортиоатными связями, который используется для лечения цитомегаловирусных инфекций.

Таблица 8

Нуклеиновые кислоты, используемые для подавления экспрессии эндогенного гена, и механизмы их действия

Лекарства на основе рибозимов

Рибозимы – это каталитические молекулы РНК, т.е. молекулы РНК, обладающие теми же функциональными свойствами, что и ферменты белковой природы. Максизимы – модифицированные рибозимы, активность которых можно контролировать с помощью малых регуляторных молекул. Природная функция многих рибозимов – катализ расщепления других молекул РНК, и эту активность можно направить на транскрипты, получаемые со специфических поврежденных генов, путем введения антисмысловой последовательности в конструкцию, содержащую рибозим

(рис. 12).

49