9. Определение резистентности

R

Устойчивость половых клеток к воздействию 1% раствора хлорида натрия. Выражается количеством (мл) раствора хлорида натрия, которое требуется добавить к 1 мл свежей спермы, чтобы наступила некроспермия. обеспечивается резистентность качеством липопротеидной оболочки. Приобретается в канале придатка (оболочка).

- устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды;

- предупреждение агглютинации;

- обусловливает отрицательный электрический заряд.

Выражается в условных единицах (например, 500).

Методы определения:

1. По Милованову;

2. По Короткову (ускоренный метод).

По Милованову

В течение первых 15-20 минут при температуре +20-25 ̊С с использованием теплого 1% раствора хлорида натрия (38-42 ̊С).

В теплую стеклянную колбу отмеривают 0,02 мл свежеполученной спермы, предварительно оцененной по активности. Из бюретки осторожно по стенке сосуда добавляют 5 мл 1% раствора натрия хлорида. Содержимое перемешиваю путем вращения в горизонтальной плоскости. С помощью стеклянной палочки наносят каплю разбавленной спермы на теплое предметное стекло, при малом увеличении определяют активность. Если хотя бы 1 клетка движется, то каждый последующий раз добавляют по 10 мл 1% раствора хлорида натрия по стенке сосуда. С каждым последующим исследованием объем капли должен быть больше. Суммируют количество мл.

R= V₁/V₂

V₁ – количество раствора хлорида натрия, V₂ – объем исследуемой спермы.

По Короткову

4 пронумерованных пенициллиновых флакона, чистых, теплых. Флакон № 1: 0,02 мл свежеполученной спермы, добавляют10 мл 1% теплого раствора хлорида натрия. Содержимое перемешивают, через 2 минуты определяют активность. Если активности нет, то резистентность = 500.

Если активность есть, то из 1го флакона переносят 0,5 мл смеси, добавляют 0,5 мл хлорида натрия. перемешивают, определяют активность через 2 минуты. Если наступает гибель половых клеток, резистентность= 1000. Если активность сохраняется, то из флакона №2 во флакон № 3 переносят четверть мл смеси, добавляют такое же количество хлорида натрия. Оценивают активность. Если активности нет, то R =2000. Если есть. То из флакона №4, где налито 10 мл хлорида натрия, в третий переносят по 0,5 мл. В конечном итоге R = 2*n + 2000 (какая-то дебильная формула).

N – количество внесений из 4 флакона в 3, при этом каждое внесение = 2000, +2000 – уже имеющаяся резистентность.

В норме у качественной спермы, полученной от жвачных, резистентность = 10000-40000, у хряка 2-5тыс, у жеребца 500-1500.

10. Определение процента живых и мертвых спермиев и их патологических форм

Определение процента живых и мертвых спермиев с помощью дифференциальной окраски по Морозову.

Дополнительная методика, более точная, чем определение активности.

При смешивании спермы с водным раствором эозина живые спермии не окрашиваются, а мертвые и слабые (с колебательным движениями) окрашиваются.

Для определения % живых и мертвых спермиев в эякуляте каплю спермы наносят на край обезжиренного предметного стекла (на электрообогревательном столике), добавляют 2-3 капли 3-5% теплого водного раствора эозина, быстро смешивают, делают тонкий мазок. Для приготовления мазка можно использовать специальное шлифовальное стекло либо покровное. Мазок подсушивают на воздухе, просматривают под микроскопом. При этом головки сперматозоидов, бывших до приготовления мазка живыми, будут светлыми, а головки мертвых сперматозоидов окрашиваются в розовый цвет.

В нескольких полях зрения микроскопа подсчитывают 500 спермиев. Высчитывают % живых по формуле: , гдеn – число живых спермиев из 500 подсчитанных. Если %ж = 80 – 8 баллов активности.

При определении процента живых и мертвых спермиев у жеребца рекомендуется использовать краситель конго-рот, при это на 100 мл 7% раствора глюкозы (изотоничного для спермиев) добавляют 1г красителя.

Метод определения процента патологических форм спермиев

Существует прямая связь между клиническими симптомами заболеваний производителей и процентом патологических форм спермиев в их сперме. Данный метод позволяет определить оплодотворяющую способность сперматозоидов. Дополнительный метод.

Методика

Сперму барана разбавляют раствором NaCl 0,9% или 2,9% раствором цитрата натрия в 20-30 раз. Сперму быка разбавляют в 10-15 раз, густую сперму кобеля, хряка и жеребца в 2-3 раза.

На край предметного стекла наносят каплю исследуемой спермы. Шлифовальным стеклом делают тонкий мазок, его сушат на воздухе, фиксируют 96% этиловым спиртом 1-2 минуты. Споласкивают водой и окрашивают 1-2% раствором эозина, фуксина, 0,1% метиленового синего. При этом перед окрашиванием на мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, на которую и наносят краситель на 1-2 минуты. Бумажку убирают, раствор краски смывают водой, подсушивают мазок на воздухе. Затем рассматривают его под микроскопом (увеличение в 500-600 раз), подсчитывают 200 клеток. При этом определяют, сколько из них имеют различные отклонения от нормального строения.

Группы: нормальные, гигантские, карликовые, с деформацией головки, с надломом у шейки, свободные головки и бесхвостые спермии, с закручиванием хвоста и ненормальным его изменением, с цитоплазматической каплей, утолщением и ненормальным искривлением хвоста, прочие патологические формы – всего 8 групп.

В сперме производителей с клинически выраженным поражением семенников процент спермиев с патологической головкой, карликовых очень высок. Сперма непригодна для осеменения.

Патология придатка: загнутый в виде петли хвостик, надлом в области головки. Появление вышеперечисленных патологических форм указывает на то, что при нормальном спермиогенезе в канале придатка создаются неблагоприятные условия для половых клеток, в результате чего они разрушаются. Петлеобразный изгиб – при изменении осмотического давления в придатке в результате присутствия патологических секретов.

При гнойном воспалении придаточных половых желез, но при нормальной функции семенников и придатков в сперме вместе с нормальными клетками гной. У таких самцов в сперме патологических форм немного, но при просмотре под микроскопом – лейкоцитоз.

Спермии с наличием цитоплазматической капли и утолщением в области головки появляются при нарушении спермиогенеза. % патологических форм спермиев принято определять 3-4 раза в год. Обязательным это мероприятия является при резком снижении качества получаемой спермы.

Максимально допустимое количество ненормальных сперматозоидов (%)

Вид животного	Патологические	Незрелые	Всего
Баран	14	2	16
Бык	18	2	20
Хряк	20	10	30
Жеребец	25	10	35