1.2.2. Глютатион-s-трансферазы (гsт)

Глютатион (ГSH) представляет собой трипептид, состоящий из глицина, цистеина и

-карбоксильную группу. Вглутаминовой кислоты, которая связана с цистеином через

результате нуклеофильной атаки глютатион тиолат аниона на электрофильный атом углерода,

кислорода, азота или серы ксенобиотика, формируется тиоэфир.

Конъюгация ксенобиотиков с глютатионом катализируется суперсемейством глютатион-S-

трансфераз (ГSТ). Эти белки

обнаружены в большинстве тканей, а именно в печени, почках, тонком кишечнике, легких и

т.д. 95% от общего содержания фермента локализовано в цитоплазме и около 5% - в

эндоплазматическом ретикулуме. Субстратами для ГSТ обычно являются гидрофобные

соединения, содержащие электрофильный атом способные реагировать с глютатионом

неферментативно. На рис. 8 представлена типичная реакция, катализируемая ГST. Однако,

из-за стереоселективности реакций с ксенобиотиками, в основном они протекают при

участии ГST. Механизм, с помощью которого ГST усиливает скорость конъюгации, состоит в

депротонировании ГSH до ГS- . В этой реакции принимает участие тирозинат Tyr-O- ,

расположенный в активном центре. Субстраты для глютатионовой конъюгации можно разделить

на две группы: 1) достаточно электрофильные для осуществления прямой конъюгации, 2)

требующие активации до реакции конъюгации. 2-я группа соединений включает в себя

оксиарены, эпоксиды алкенов, ионы нитрония, ионы карбония и свободные радикалы. ГST

представляет собой димер, составленный из комбинации 2-х идентичных или неидентичных

субъединиц. Описаны следующие генные семейства ГST, кодирующие цитозольные ферменты:

alpha, mu, theta, pi, zeta. Классификация построена на основе структурных,

иммунологических и функциональных свойств. Показано, что ГST, принадлежащие к различным

классам, могут обладать перекрывающейся субстратной специфичностью. Субъединицы,

принадлежащие к различным классам, имеют менее 50% гомологии аминокислотной

последовательности. Субъединицы в пределах одного класса имеют около 70% гомологии.

Гедеродимеры могут формироваться только при участии субъединиц, принадлежащих к одному

классу. Семейства цитозольных ГST имеют общее эволюционное происхождение, причем

-классу. Микросомальные формы фермента возникли изпредковый ген наиболее близок к

отдельной эволюционной ветви.

ГST представлены суперсемейством мультифункциональных изоферментов, которые

способствуют процессам детоксикации, используя различные механизмы, включая 1)

каталитическую инактивацию широкого спектра ксенобиотиков через конъюгацию с ГSH; 2)

некаталитическое связывание определенных ксенобиотиков; 3) восстановление липид- и ДНК-

гидропероксидов через экспрессию активности ГSH-пероксидазы 2.

ГST играют важную роль в детоксикации Афлатоксин В1-8,9-эпоксида. Показано, что

у грызунов отсутствие фермента, отвечающего за катализ этой реакции, связано с

повышенной чувствительностью к раку печени. Интенсивно изучается метаболизм известного

ПАУ – бенз[а]пирена (БП). Показано, что ГST печени человека обладают каталитической

активностью по отношению к реактивному метаболиту БП – БП-4,5-оксиду. Это соединение

дает позитивный ответ в тесте на мутагенность, хотя и не вовлекается напрямую в

канцерогенез. Кроме метаболизма канцерогенов, ГST детоксицирует широкий спектр других

ксенобиотиков, например фосфорорганические инсектициды, гербициды, пестициды,

химиотерапевтические лекарства. Дополнительно к защитным свойствам, ГST участвует в

биосинтезе биологически активных молекул, включая лейкотриены и простагландины.

1.2.3. N-ацетилтрансферазы

N-ацетилирование – основной путь биотрансформации для ароматических аминов или

ксенобиотиков, в том числе и лекарств, содержащих гидразогруппу (R-NH-NH2), которые

превращаются в ароматические амиды (R-NH-COCH3) или гидразиды (R-NH-NH-COCH3),

соответственно. Первичные алифатические амины редко подвергаются N-ацетилированию за

исключением цистеиновых конъюгатов, образующихся из глютатионовых, которые, в свою

очередь, путем N-ацетилирования в почках превращаются в меркаптуровую кислоту. Многие N-

ацетилированные метаболиты менее, чем исходные соединения, растворимы в воде. Однако в

отдельных случаях, например, для изониазида, N-ацетилирование облегчает экскрецию

метаболитов с мочой.

Реакция N-ацетилирования катализируется ферментами, называемыми N-

ацетилтрансферазы (NAT) и требует присутствия ацетил-кофермента А (Ац-КоА) в качестве

кофактора. Реакция протекает в два последовательных шага. Первым этапом ацетильная

группа Ац-КоА переносится к цистеиновому остатку внутри активного центра фермента с

высвобождением кофермента А:

E-SH + КoA-COCH3 →E-S-COCH3 + КoA-SH

Вторым шагом ацетильная группа Ац-КоА переносится с ацетилированного фермента

на аминогруппу субстрата. Для сильноосновных аминов скорость N-ацетилирования

определяется первым шагом , тогда как для слабоосновных – вторым. В определенных

случаях NAT могут катализировать реакцию О-ацетилирования.

NAT – цитозольные ферменты, которые были найдены в печени и многих других

тканях у большинства видов млекопитающих, за исключением лис и собак, неспособных к N-

ацетилированию ксенобиотиков.

У кроликов, мышей экспрессируется две формы NAT, обозначаемых NAT1 и NAT2. По

последним данным у человека идентифицировано, кроме этих двух классов, еще 3 класса

ферментов: арилалкин-N-ацетилтрансфераза (AANAT), L1-протеин-регулятор адгезии клеток

(L1 CAM) и гомолог Saccharomyces cerevisiae N- ацетилтрансферазы у человека (ARD1).

NAT1 и NAT2 являются близкими по первичной структуре (79-95% гомологии

аминокислотной последовательности, в зависимости от вида). У всех белков в активном

центре присутствует цистеин (Cys68). Оба белка кодируются генами, не содержащими

интронов. Гены NAT хотя и расположены на одной хромосоме, но регулируются независимо

друг от друга. NAT1 экспрессируется в большинстве тканей организма, тогда как NAT2, по-

видимому, только в печени и кишечнике. Эти ферменты отличаются по субстратной

специфичности, хотя и имеется перекрывание. Субстратами, предпочтительно N-

ацетилируемыми человеческой NAT1, являются парааминосалициловая кислота,

парааминобензойная кислота, сульфаметоксазол. Субстраты, преимущественно N-цетилируемые

при участии NAT2, включают изониазид, гидралазин, сульфаметазин, дапсон. Некоторые

ксенобиотики, например, 2-аминофлуорен одинаково хорошо метаболизируются обоими

ферментами.

Генетический полиморфизм N-ацетилирования показан у хомяков, мышей, кроликов.

Вариации в NAT2-локусе отвечают за классический полиморфизм ацетилирования,

подразделяющий индивидуумов на «быстрых», «средних» и «медленных» ацетиляторов.

Определенные вариации NAT1-локуса приводят к усилению активностей N-, О- или N,О-

ацетилирования по сравнению с диким типом. Серия клинических наблюдений, проведенных в

50-х годах, установила существование так называемых ««медленных»» ацетиляторов

антитуберкулезного лекарства изониазида. Встречаемость этого фенотипа довольно высокая

на Среднем Востоке (около 70% в Египте и Саудовской Аравии), средняя в Европе, на

Кавказе, в Америке и Австралии (около 50%), низкая в азиатской популяции (менее 25% в

Китае, Японии, Корее). В настоящее время варианты по статусу ацетилирования описаны и у

человека и у животных. Фенотип медленного ацетилирования возникает в результате мутаций

NAT2 гена, которые приводят либо к снижению активности фермента, либо к снижению его

стабильности. Например, точковая мутация в 341 нуклеотиде приводит к аминокислотной

замене Ile114 - Thr и снижает максимальную скорость N-ацетилирования (Vmax) без

изменения Кm для связывания субстрата или стабильности фермента. Эта мутация часто

встречается среди кавказской популяции, но редко среди азиатской. Внутри фенотипа

медленного ацетилирования существуют значительные вариации в скорости ацетилирования

ксенобиотиков, поскольку различные мутации оказывают различное действие на активность

и/или стабильность NAT2. У «медленных» ацетиляторов значительным оказывается N-

ацетилирование “NАT2-субстратов” при помощи NAT1.

Генетический полиморфизм NAT2 оказывает токсикологическое и фармакологическое

влияние на метаболизм лекарств, которые N-ацетилируются этим ферментом. Например,

фармакологический эффект антигипотензивного лекарства гидралазина является более

продолжительным у «медленных» ацетиляторов, тогда как медленные ацетиляторы

предрасположены к различным лекарственным отравлениям. «Медленные» ацетиляторы, которые

к тому же дефицитны по глюкозо-6-фосфатдегидрогеназе, особенно склонны к гемолизу под

действием определенных сульфонамидов. «Быстрые» ацетиляторы предрасположены к

миелотоксическим эффектам амонафидов, поскольку N-ацетилирование замедляет выведение

этих антинеопластических лекарств.