6.6. Ингибирующее фосфорилирование.

Cdk могут также ингибироваться фосфорилированием. Ингибиторное фосфорилирование

вносит вклад в отсчет времени митоза. До митоза комплекс циклин В-cdc2 (Cdk1)

инактивирован фосфорилированием по треонину-14 и тирозину-15. Фосфорилирование остатков

у позвоночных осуществляется Myt1 и Wee1 соответственно. К концу G2 резкое

дефосфорилирование этих двух остатков активирует cdc2 и запускает митоз.

Дефосфорилирование осуществляется фосфатазами семейства CDC25. Во время митоза Myt1,

Wee1 и CDC25 фосфорилированы. Это уменьшает активность Myt1, тогда как активность CDC25

увеличивается, что способствует активации cdc2. Интересно, что циклин В-cdc2 может

непосредственно активировать CDC25. Такая прямая обратная связь и обеспечивает резкое

дефосфорилирование. Кроме циклин В-cdc2 в фосфорилировании CDC25 принимают участие

представители семейства Polo киназ (Polo like kinase 1 - Plk1 у млекопитающих).

6.7. Регуляция циклинов

Регуляция циклинов осуществляется на двух уровнях: транскрипции генов и деградации

белка. Регуляция транскрипции генов циклинов у высших эукариот изучена на примере

перехода ограничительной точки клеточного цикла. Центральную роль в этом переходе

играет E2F, фактор транскрипции некоторых генов, необходимых для синтеза ДНК в S фазе.

Он стимулирует также транскрипцию генов циклина А, циклина Е и своего собственного

гена. Белок pRb ингибирует E2F, связываясь с последним в G1 фазе.

Факторы роста стимулируют транскрипцию циклина D через Ras-Raf-MAP сигнальный

каскад или под действием цАМФ. Происходит накопление комплексов циклин D-Cdk4, которые

начинают фосфорилировать Rb, что приводит к его диссоциации от E2F. Освободившийся E2F

стимулирует транскрипцию своего гена и гена циклина Е. Образующийся вследствие этого

комплекс CDK2-цЕ, еще активнее фосфорилирует pRb. Таким образом, сеть эффектов через

петлю положительной обратной связи приводит к быстрому возрастанию E2F зависимой

транскрипции и переходу клетки в начало S фазы. Вскоре после этого в клетке появляются

комплексы Cdk2-цА, которые фосфорилируют E2F, уменьшая его способность связываться с

ДНК.

Другим способом регуляции циклинов является их разрушение протеолизом. Таким

образом контролируется, например, выход из митоза. Деструкция митотических циклинов

необходима для начала телофазы и подготовки к следующему циклу. Возле N-конца

митотические циклины А и В несут небольшую последовательность, называемую боксом

деструкции. Эта последовательность необходима для конъюгации циклина с убиквитином,

который является маркером для узнавания циклина протеазой. Большая часть цитозольного

протеолиза осуществляется протеосомами. Протеосомы - это нелизосомальные

мультикаталитические протеиназы, обнаруженные у эукариот, широко распространенные в

цитоплазме. Они обладают 20S каталитическим ядром (М = 700 кд) которое осуществляет АТФ-

зависимую деградацию убиквитинированных белков. 20S протеосома состоит из 14

субъединиц, представляющих собой различные протеазы. Они образуют бочкообразную

структуру с активными центрами внутри. Большие протеазные комплексы, по крайней мере,

из десяти различных полипептидов образуют дно и крышку такой бочки. Из роль, видимо,

заключается в транспорте убиквитинированных белков в центр бочки.

Ключевым регуляторным компонентом в деструкции митотических циклинов является

мультисубъединичный комплекс APC (anaphase promoting complex) или циклосома. Этот

комплекс осуществляет присоединение убиквитина к циклинам и другим субстратам. Комплекс

имеет различную субстратную специфичность в переходе метафаза-анафаза и выходе из

митоза, так как связан в эти периоды с двумя различными регуляторными белками - Сdc20 и

Hct1 соответственно. Одним из субстратов ACP-Сdc20 является комплекс белков секурина и

сепарина, который удерживает вместе сестринские хроматиды хромосомы. APC-Сdc20

способствует разрушению секурина, под действием освободившегося сепарина сестринские

хроматиды расходятся, то есть осуществляется переход в анафазу. Комплекс APC-Hct1

осуществляет убиквитинирование циклина В. АСР активируется после длительного лаг-

периода посредством циклин А-Cdk2 и инактивируется под действием G1 циклинов.

Таким образом, молекулярные механизмы, которые запускают все события клеточного

цикла, должны работать по принципу "все или ничего", действуя необратимо и постоянно.

Клеточный цикл можно рассматривать как продукт программы резкого возрастания и падения

активности Cdk. Активация одного циклин-киназного комплекса должна быть не только

триггером событий клеточного цикла, но и должна инициировать активацию следующего

циклин-киназного комплекса. Таким образом, запрограммированная последовательность

передачи сигнала от одного комплекса к другому представляет собой часы клеточного цикла.

Классическим примером автономного колебания активности Cdk является колебание

активности комплекса циклин В-cdc2 (MPF) в раннем эмбрионе лягушки Xenopus. После

деструкции комплекса циклин А-cdc2 и выхода из S фазы постоянный синтез циклина В

приводит к его накоплению и, следовательно, образованию комплексов циклин В-cdc2.

Первоначально эти комплексы неактивны, так как они ингибированы фосфорилированием по

треонину-14 и тирозину-15 киназой Wee1. Однако по мере их накопления достигается порог

концентрации, при котором они могут фосфорилировать CDC25 и Wee1, вызывая

соответственно их активацию и ингибирование. Фосфорилированная CDC25 дефосфорилирует и

активирует циклин-киназный комплекс. Положительная обратная связь этих двух процессов

вызывает резкое возрастание киназной активности циклин В-cdc2. Повышенная киназная

активность вызывает переход клетки к митотическому статусу через фосфорилирование

различных клеточных субстратов. После слабо изученной лаг-фазы активированный циклин-

киназный комплекс инициирует деградацию циклина под действием убиквитин-зависимого

протеолиза. Разрушение циклина вызывает потерю киназной активности и выход из митоза.