3.8. Тхдд

При исследованиях регуляции токсичных процессов большой интерес представляет

соединение, известное как диоксин или 2,3,7,8-тетрахлородибензо-р-диоксин (ТХДД) (Рис.

28).

Рис. 28. Структура 2,3,7,8-тетрахлодибензо-p-диоксина

Это сильнодействующее соединение, оказывающее вредное воздействие на многие виды

животных. ТХДД образуется при нагревании хлорированных фенолов или при горении

хлорсодержащих углеводородов, входящих в некоторые виды пластика. В окружающей среде в

заметных количествах ТХДД обнаруживается со времен 2-ой мировой войны в связи с

развитием нефтеперерабатывающей промышленности. В прошлом большое количество ТХДД

выбрасывалось в окружающую среду в результате аварий на производстве, связанном с

хлорированием фенолов и, как загрязнения, при рутинном синтезе хлорированных фенольных

продуктов (определенные гербициды). В малых количествах ТХДД обнаруживается как

побочный продукт при хлорировании органических материй (отбеливание бумаги). Однако

по оценкам экспертов половина ТХДД, генерируемого ежегодно в США, образуется в

результате сгорания отходов. Горение при достаточно высоких температурах приводит к

распаду ТХДД, однако такая температура обычно не достигается.

ТХДД известен как сильный канцероген для ряда видов животных. У мышей, крыс,

хомячков, рыб, обрабатываемых длительное время этим соединением, быстро развиваются

опухоли. Некоторые исследователи полагают, что ТХДД является первичным промотором,

вызывая рак при кормлении в течение длительного периода. Они полагали, что это

соединение просто усиливает развитие опухолей, возникающих из-за эндогенных

повреждений ДНК. Идея была привлекательна, поскольку сам по себе ТХДД не

взаимодействовал с ДНК и не образовывал аддукты. Более того, биотрансформация ТХДД

происходит слабо, и высоко реакционноспособные метаболиты не образуются с

необходимой скоростью. ТХДД не является промотором в общем случае, он неэффективен

для самцов крыс и некоторых видов мышей.

Помимо рака ТХДД оказывает ряд негативных эффектов. В организме человека он

метаболизируется с образованием хлорина, который удерживается от 5 до 20 лет, а сам

ТХДД удерживается в жировой ткани и выводится медленно. Время его полувыведения

оценивается в 1 год и более. У мышей во время внутриутробного развития он вызывает

появление расщепленного неба. Также это соединение препятствует созреванию Т-

лимфоцитов в тимусе, т.е. ТХДД является иммуносупрессором. Среди разных видов животных

существует ярко выраженная дозо-зависимость: например, у морских свинок LD50 составляет

2 мкг/кг веса, а у хомячков более 5000 мкг/ кг веса. В табл. 6 приведены данные о

чувствительности разных видов к токсину:

Табл. 6. Чувствительность к ТХДД

ВИД	Способ передачи	LD50 (мг/кг)	ED50 (мг/кг)
Свинья	перорально	2	0.5-1
Обезьяна	перорально	50
Крыса	через легкие	25-60	15
Кролик	перорально	115
	через кожу	275
Мышь	через легкие	132	60
Хомяк	через легкие	>3000	>300
	перорально	5051

Диоксин является мощным индуктором цитохрома Р450 1А1 и токсичен для

репродуктивной системы. Репродуктивные эффекты ТХДД имеют особое значение. Около 20 лет

назад было показано, что незначительная доза ТХДД с пищей приводит к бесплодию у

резус-макак. У самок резус-макак, получавших ТХДД, развивался эндометриоз, причем

эндометриальные клетки обнаруживались и вне матки, в брюшной полости. ТХДД

предотвращает эстроген-зависимый рост клеток карциномы молочной железы в культуре.

В отсутствие твердых доказательств и информации о механизме действия приходится

допускать значительный разброс в оценке риска. Используя правдоподобную оценку

эффективности ТХДД как канцерогена у грызунов и производя линейную экстраполяцию для

подсчета риска возникновения рака у человека, можно получить величину дневной дозы ≈

10пкг. Напротив, если существует пороговая величина для действия ТХДД (характерная

для промоторов рака), то уровень допустимой дневной дозы может составлять ≈ 500пкг.

В настоящее время известно, что ТХДД связывается со специфическим рецепторным

белком (Ah рецептор) в цитоплазме клетки, который затем мигрирует в клеточное ядро и

стимулирует транскрипцию определенных генов (возможно репрессируя транскрипцию

других). Показано, что этот внутриклеточный рецептор взаимодействует с гормонами

(эстроген, прогестерон, тестостерон, гидрокортизон и другие), витаминами (A, D) и

другими малыми молекулами (некоторые липиды), причем каждое соединение взаимодействует

специфичным образом. Принимая это во внимание, можно предположить, что ТХДД

стимулирует синтез таких соединений или белков, которые меняют поведение клетки, что в

итоге ведет к появлению ответа на токсичность. Идентификация таких белков, которые

могут сильно варьировать в зависимости от ткани, может быть большим шагом вперед. ТХДД

может оказывать негативные эффекты на здоровье не прямо, а через метаболическую

чувствительность. Этот сценарий действия отличается от транскрипционного. Во многих

тканях ТХДД стимулирует синтез CYP1A1, 1A2, 1B1 и, возможно, других изоферментов

цитохромов Р450. Они, в свою очередь, метаболизируют имеющиеся субстраты, приводя к

появлению токсичных интермедиатов, которые повреждают ДНК и меняют поведение клетки.

Исходя из этого, можно объяснить чувствительность самок, но не самцов крыс к развитию

рака печени. У самок цитохромы Р450 1А1 и 1В1 метаболизируют эстроген с образованием

катехолов, которые далее могут окисляться до хинонов и образовывать супероксид. Хиноны

могут формировать аддукты с ДНК, а супероксид (как и другие реакционноспособные

радикалы кислорода) могут окислять основания ДНК. Известно, что сам хинон чувствителен

к окислению, и, действительно, введение ТХДД приводит к повышению уровня окисленного

хинона в печени самок, но не самцов крыс. Также было отмечено, что предварительная

обработка ТХДД культур клеток делает их чувствительными к токсичным эффектам

проканцерогенов, активируемых цитохромами Р450, но которые сами по себе являются

слабыми индукторами. Для объяснения некоторых эффектов ТХДД был предложен

альтернативный сценарий, включающий Ah-рецептор, но не транскрипция генов напрямую.

Так, лиганд-рецепторный комплекс с некоторыми гормонами может влиять на генную

экспрессию, стимулированную другими факторами транскрипции. Этот эффект имеет место на

уровне белковых факторов, связывающихся друг с другом. Такой подход представляется

правдоподобным, поскольку внутриклеточные рецепторы часто существуют в виде

гетеродимеров (например, тиреоидный гормон обычно связывается с рецептором, состоящим

из 2-х субъединиц, одна из которых непосредственно связывает гормон, а вторая –

ретиноевую кислоту). Сообщалось, что в культурах клеток ТХДД препятствовал нормальному

связыванию не только гидрокортизона, но и ретиноевой кислоты. Некоторые исследователи

полагают, что ТХДД дополнительно может запускать определенные метаболические пути с

участием киназ, влияющих на многие свойства клетки. И хотя некоторые детали механизма,

благодаря которому комплекс ТХДД-Ah-рецептор оказывает токсичное действие, еще

предстоит уточнить, знания о том, что эффекты ТХДД опосредуются рецептором, позволяют

уточнить дозо-зависимые отношения. Степень ответа регулируется степенью занятости Ah-

рецептора лигандом (т.е. ТХДД). Согласно определению, рецептор занят на 50%, когда

концентрация лиганда равна константе диссоциации (Kd) рецептора. Исследования на

стероидных гормонах, действие которых опосредовано рецептором, показали, что изменения

концентрации гормона более чем в 10 раз превышающие Kd, оказывают слабый биологический

эффект вследствие насыщения рецептора. Аналогично, когда концентрация гормона

составляет одну десятую или менее от величины Kd, количество занятых молекул рецептора

недостаточно для оказания заметного биологического эффекта. Центром области

концентраций, при которых наблюдаются ожидаемые эффекты, является величина Kd, а

границы области составляют величины от 10 раз больше до 10 раз меньше Kd. Для Ah-

рецептора человека величина Kd составляет 0.1-1нМ. Следовательно, доза ТХДД,

составляющая менее 1пкМ, которая дает эффективное связывание с рецептором, не окажет

вреда. Такую дозу можно определить, эмпирически, исследуя отношение между вводимой

дозой и индукцией Р450 1А1 на животных. Проводя такого рода анализ, необходимо помнить

о сделанных допущениях. Во-первых, предположение, что лиганд в количестве ниже, чем

10% от Kd биологически неактивен, иногда сомнительно. В некоторых системах

(ацетилхолиновый рецептор в нейро-мышечном синапсе) по-видимому, существуют «резервные»

рецепторы. Это предположение исходит из наблюдений, что кривая зависимости ответа от

дозы сдвигается к более низким, чем ожидалось концентрациям. Максимальный ответ

получался с единственной занятой фракцией рецептора, и более низкая концентрация имеет

пропорционально больший эффект, чем ожидалось. Эту проблему следует принимать во

внимание при оценке риска. Во-вторых, можно допустить, что не все эффекты ТХДД требуют

участия рецептора, хотя наиболее значимые действительно являются опосредованными.

Делается заключение, что ТХДД является столь эффективным ввиду того, что он обладает

высокой аффинностью по отношению к Ah-рецептору и долго не выводится из клетки. Другой

продукт сгорания - хлорированный дибензофуран обладает такими же свойствами. Существует

множество других лигандов для Ah-рецептора, среди которых полициклические углеводороды

и планарные полихлорированные бифенилы. Однако, существуют и менее известные

соединения, которые связываются с рецептором и активируют транскрипцию цитохрома Р450

1А1, включая индол-3-карбинол, который встречается в некоторых употребляемых в пищу

растениях. Существует множество тестов для оценки специфичности связывания с Ah-

рецептором. По аналогии со стероидными гормонами оказалось, что действие многих

токсичных соединений (к их числу относятся и лекарства в случае неправильного

употребления) направлено на определенные рецепторы. Некоторые исследователи высказывают

предположения о существовании эндогенных лигандов к Ah-рецептору. Полагают, что этот

рецептор необходим для функционирования клеток в норме, поскольку нокаутные по этому

рецептору мыши имели дефекты печени и возможно других тканей. Поиск эндогенных лигандов

и их идентификация помогут пролить свет на механизм действия ТХДД.