5.7.1. Rb белок

Ретинабластома - рак сетчатки, встречающийся у детей. Он передается по наследству,

либо возникает спорадически. Заболевание связано с инактивацией обеих копий гена Rb и,

как следствие, с отсутствием в клетке белкового продукта. Инактивация происходит в

результате делеции локуса q14 тринадцатой хромосомы, несущего данный ген. Признак

является рецессивным и проявляется в потомстве, если оба родителя несут хотя бы по

одной инактивированной копии гена. Ненаследственная форма ретинобластомы крайне редка,

так как для ее возникновения необходимо произойти мутациям в обеих копиях гена Rb.

Кроме ретинобластомы инактивация Rb вызывает многие опухоли легких, мочевого пузыря и

молочной железы. Как уже упоминалось выше, инактивация Rb на белковом уровне может

осуществляться продуктами генов раковых вирусов, таких как SV40, аденовирус и вирус

папилломы.

Rb является фосфопротеином, играющим важную роль в регуляции перехода клетки из G1 в S

фазу (Рис. 31 ).

Рис. 31. Белок RB в регуляции клеточного деления

Центральную роль в этом переходе играет E2F, фактор транскрипции некоторых генов,

необходимых для синтеза ДНК в S фазе. Он так же стимулирует транскрипцию генов циклина

А, циклина Е и своего собственного гена. Белок pRb ингибирует E2F, связываясь с

последним в G1 фазе. Факторы роста стимулируют транскрипцию циклина D. Происходит

накопление комплексов циклин D - Cdk4, которые начинают фосфорилировать Rb, что

приводит к его диссоциации от E2F. Высвободившийся E2F стимулирует транскрипцию своего

гена и гена циклина Е. Образующийся вследствие этого комплекс CDK2-цЕ, еще активнее

фосфорилирует pRb. Таким образом, сеть эффектов через петлю положительной обратной

связи приводит к быстрому возрастанию E2F зависимой транскрипции и переходу клетки в

начало S фазы. В конце митоза рRb дефосфорилируется. Переэкспрессия Rb препятствует

клеточному росту. Это продемонстрировано на примере клеточной линии остеосаркомы,

которая потеряла этот ген. При внесении гена Rb в культуру ее рост прекращается. Были

обнаружены сходные с Rb белки, способные взаимодействовать с другими представителями

семейства факторов транскрипции E2F.

5.7.2.Белок р53

Р53 - раковый супрессорный ген. Он получил свое название по молекулярной массе

белкового продукта. Ген наследуется как аутосомная доминанта при синдроме Ли-Фраумени -

редкой форме наследственного рака. У больных этим синдромом развивается рак различных

органов, что связано с мутациями в гене р53. Изучение этих мутаций открыло новые

свойства р53 и объяснило его связь с возникновением рака.

P53 - ядерный фосфопротеин, который открыли в SV40 трансформированных клетках, в

которых он связан с Т-антигеном. Повышенная экспрессия р53 была обнаружена во многих

раковых клеточных линиях. В ранних экспериментах вставка клонированного р53 была

найдена в иммортализованных клетках, в связи с чем его назвали онкогеном с обычной

доминантной функцией. Но все трансформирующие формы р53 выключались в мутантных формах

белка. И тогда они попали в категорию доминантных негативных мутантов, которые

функционируют через подавление функции в диком типе. Наиболее общее формой доминантного

негативного мутанта является та, которая формирует гетеродимерный белок, объединяющий

субъединицу мутировавшего и дикого типа, в котором субъединица дикого типа не

функционирует. Вероятно, р53 существует как тетрамер.

Трансформированный фенотип образуется либо делецией обоих аллелей или точечной мутацией

в одном из аллелей, которая продуцирует доминантный негативный фенотип . Обе ситуации

найдены в раковых опухолях человека. Мутации р53 накапливаются во многих во многих

типах рака человека, вероятно из за того, что потеря р53 стимулирует рост клетки, а для

остановки роста нужен дикий тип р53. Многообразие видов рака дает основания

предполагать, что р53 не тканеспецифичен, то есть он вовлечен в общий контроль

пролиферации и потеря этого контроля может быть вторичным событием, которое стимулирует

рост многих опухолей. Такая интерпретация предполагает, что нормальные клетки растут в

сдержанной манере, которая обычно ингибируется р53.

Какова функция р53 на молекулярном уровне?

р53 был открыт как белок, связывающийся с большим Т-антигеном вируса SV40. В отличие от

дикого типа, мутантные формы белка не способны связывать Т- антиген. Связывание дикого

типа р53 с Т-антигеном коррелирует с его способностью стимулировать репликацию вируса.

Одна возможность - р53 дикого типа связывается с клеточными аналогами Т-антигена, при

этом ингибируется активность последнего. У мутантных форм такая способность теряется.

Белок р53 является ДНК связывающим белком, узнающим специфичный мотив из 10 п.о. в

активном промоторе, который содержит этот мотив. Для некотоых генов р53 может быть

супрессором. р53 также регулирует экспрессию генов, контролирующих клеточный цикл. Этот

белок связывается с последовательностью ДНК PuPuPuC(A/T)(T/A)GpyPyPy, которая

содержится в некоторых промоторах.

Сам белок р53, состоящий из 392 аминокислот, состоит из шести доменов:

1.N-концевой домен (1-50 амк.) вовлечен в транскрипционную активацию генов-мишеней

(р21- ингибитор Cdk и другие гены, участвующие в остановке клеточного цикла, GADD45, 14-

3-3-d, Bax). Он же ответственен за взаимодействие с Mdm2 - ингибитором р53. В этом

участке находятся 7 остатков серина и треонина, являющиеся мишенями для киназ.

2.Дополнительный транскрипционный домен (43-73 амк.) для активации генов-мишеней.

3. Гибкий пролин-богатый домен (73-97амк.), в котором выявлены элементы РххР, важен

для полного проявления супрессорной активности. Участвует в запуске апоптоза. Мишени -

TBP, TFIID, SpII, HIF-1, STAT-5, Bcl-2, MDR-1, рецептор тироидного гормона.

4. Центральный домен (100-300 амк.), который узнает специфические последовательности

ДНК. Именно в этом районе обнаружено большинство мутаций в раковых опухолях.

5. Участок, отвечающий за ядерную локализацию р53 (305-323амк.).

альфа-спираль - участок, отвечающий за тетрамеризацию (323-356амк.).

6. Основный домен (363-392амк.) является мишенью для модифицирующих ферментов (киназ,

ацетилаз, гликозилаз). В немодифицированной форме он препятствует образованию комплекса

с ДНК. Кроме того, С-конец может может неспецифически связываться с одноцепочечной ДНК,

непарными основаниями и концама ДНК, что указывает на его участие в узнавании

повреждений ДНК и запуске репарации.

Р53 называют "стражем генома". Он активируется в ответ на различные виды стресса и

останавливает пролиферацию, а вслучае более серьезных повреждений запускает программу

апоптоза - гибели клетки. Около 50% опухолей человека имеют дефектный р53. Большинство

мутаций р53 возникает в позициях, где аминокислоты высококонсервативны. Это

предполагает, что эти мутации связаны с консервативными функциями. Охарактеризованные

мутации р53 вызывают эффекты, связанные с изменениями свойств белка, включая его время

полужизни от 20 минут до нескольких часов, изменения его конформации, изменения его

клеточной локализации от ядерной к цитоплазматической, изменения способности

связываться с ДНК или Т-антигеном. Такая плейотропность делает затруднительным

определить, какой из них связан с супрессией рака.

Кроме Rb и р53 существует множество других генов супрессоров опухолей. В частности, к

ним относятся р21, p16 и р27 - ингибиторы Cdk, которые будут рассмотренные в следующей

главе, WT1 - супрессор транскрипции некоторых факторов роста и онкогенов bcl-2 и c-myc,

NF1 - подавляет активность ras за счет активации ГТФаз.