Практическая работа №6

Тема: ПЦР-амплификация с ДНК-зондами флуоресцентно меченными ДФ-520/560

Цель занятия: Освоить метод амплификации ДНК с флуоресцентной меткой

Задачи:

1. Освоить теоретический курс условий проведения амплификации с флуоресцентной меткой

2. Освоить технику программирования различных видов амплификаторов

3. Выучить основные технологические приемы подготовки проб к амплификации с флуоресцентной меткой

Ход работы:

Материалы и оборудование для проведения практического занятия.

1. Амплификатор «Терцик» с возможностью программирования и контро­­ля за процес­сом без использования персонального компьютера

2. ПЦР детектор Джин- Предназначен для регистрации результатов ПЦР при использовании тест-систем, основанных на принципах флуоресцентной детекции (Рисунок 15)

3. П ЦР бокс БАВ-ПЦР- «Ламинар.-с»

4. Микроцентрифуга-вортекс FV-2400

5. Пипетка-дозатор «Колор» ( 0.5-10 мкл; 5-50 мкл (2 шт); 20-200 мкл; 100-1000 мкл)

6. Реакционная смесь, запечатанная парафином

7. Раствор Taq-полимеразы

8. Минеральное масло

9. Положительный контрольный образец

Комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК методом полимеразной цепной, основан на принципах флуоресцентной детекции (гибри­дизация с зондами типа beacons (маячки)). Для детекции специфического продукта используется зонд с красителем FAM, для внутреннего контроля зонд с HEX.

1. Промаркируйте пробирки с запечатанной парафином реакционной смесью (с учетом пробирок для положительного контрольного образца - ПК, отрицательного контрольного образца - ОК и двух нормировочных пробирок - ФОН).

2. Добавьте в каждую пробирку (кроме пробирок ФОН), не повреждая слой парафина, по 10 мкл тщательно перемешанного раствора Taq-полимеразы. В пробирки, маркированные ФОН, добавьте по 10 мкл ПЦР-буфера без Taq-полимеразы.

3. Сверху наслоите 20 мкл минерального масла (приблизительно 1 капля из наконечника на 200 мкл).

А) Нанесите на стенку опытных пробирок 5 мкл выделенного из образца препарата ДНК, отрицательного контроля или положительного контрольного образца ДНК.

Б) Нанесите на стенку нормировочных пробирок 5 мкл раствора отрицательного контрольного образца, прошедшего пробоподготовку.

4. Центрифугируйте пробирки на вортексе в течение 3-5 сек.

5. Поместите опытные и нормировочные пробирки с подготовленной смесью в амплификатор. Для проведения реакции используйте программы, приведенные в табл. 1-3, для амплификатора типа МС₂, запрограммированного на объем 35 мкл в режиме «Precise» («Точный»).

Таблица 6 Режим амплификации 1

Температура	Время	Количество циклов
94°С	1 мин	1
94°С 64°С 67°С	5 с 5 с 5 с	5
94°С 64°С 67°С	1 с 5 с 5 с	40
10°С	хранение

Таблица 7 Режим амплификации 2

Температура	Время	Количество циклов
94°С	1 мин	1
94°С 67°С	5 с 15 с	5
94°С 67°С	1 с 15 с	40
10°С	хранение

Примечание 1. Циклированные нормировочные пробирки допускается использовать многократно в течение 1 мес при очередной детекции результатов ПЦР с опытными пробирками из той же серии комплекта реагентов для ПЦР-амплификации ДНК. Циклированные нормировочные пробирки необходимо хранить при +4°С в темном месте. При проведении детекции нормировочные пробирки должны иметь комнатную температуру, для чего за 1 час до проведения детекции их необходимо достать из холодильника.

Таблица 8 Режим амплификации 3

Температура	Время	Количество циклов
94°С	1 мин	1
94°С 67°С	5 с 15 с	5
94°С 67°С	1 с 15 с	30
10°С	хранение

Режим амплификации 1 предназначен для выявления следующих. микроорганизмов:

Хламидия трахоматис (Chlamydia trachomatis), Микоплазма гениталиум (Mycoplasma genitalium) Уреаплазма парвум (Ureaplasma parvum), Уреаплазма уреалитикум (Т-960) (Ureaplasma urealyticum), Трихомонас вагиналис (Trichomonas vaginalis), HHV-6, HHV-8, Цитомегаловирус (CMV), Нейссерия гонореи (Neisseria gonorrhoeae), Кандида альбиканс (Candida albicans), Бордетелла пертуссис (Bordetella pertussis), Легионелла пневмофила (Legionella pneumophila), Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori), Коринебактерия дифтерия (Corynebacterium diphtheriae) токсигенные штаммы, Стрептококк группы А (Streptococcus pyogenes), Токсоплазма гондии (Toxoplasma gondii), Вирус Эпштейна-Барр (ЕВУ), Вирус варицелла зостер (VZV)

Режим амплификации 2 предназначен для выявления следующих микроорганизмов:

Микоплазма хоминис (Mycoplasma hominis), Уреаплазма уреалитикум (Т-960) и Уреаплазма парвум (Ureaplasma urealyticum+Ureaplasma parvum), Вирус простого герпеса 1,2 (HSV-1,2), HPV 16, HPV 18, Микобактерия туберкулеза- микобактерия бовис комплекс (М. Tuberculosis - М. Bovis)

Режим амплификации 3 предназначен для выявления следующих микроорганизмов:

Гарднерелла вагиналис (Gardnerella vaginalis)

II. Проведение детекции и учет результатов ПЦР-амплификации ДНК Детекция и учет результатов ПЦР-амплификации ДНК проводится с помощью ПЦР-детектора Джин, согласно инструкции к прибору (пороговые значения для специфического продукта составляют 1,75-2,10, для внутреннего контроля - 2,50) или с помощью гель-электрофореза

П орядок работы с прибором Джин

Рисунок 16. Главное окно программы

Рисунок 17. Окно создания протокола

Для создания протокола необходимо последовательно заполнить колонки «с» и «по» (соответственно первый и последний номер пробирок), выбрать тест и занести количество фоновых пробирок (Рисунок 16).

В поле «Протокол №» заносится информация о номере протокола. А в поле «Оператор» выбирается имя оператора .

1. Создаем новый протокол детекции

2. После создания протокола приступаем к проведению детекции результатов ПЦР.

Для продолжения детекции нажимаем кнопку , далее работа продолжается и на экран выводится результат (Рисунок 17).

2. Результаты обработки сигналов представлены в виде таблицы и гистограммы нормированных величин сигналов (Рисунок 18, 19).

Рисунок 18. Главное окно программы с результатами анализа

Рисунок 19. Варианты результатов анализа

Контрольные вопросы:

5. Расскажите теоретические основы работы диагностических наборов с ДНК-зондами флуоресцентно меченными

6. Устройство и принципы работы флуоресцентного детектора

7. Используя интерфейс компьютера, подготовьте Протокол детекции флуоресценции для качественного анализа

8. Прокомментируйте полученный результат детекции диагностических наборов с ДНК-зондами флуоресцентно меченными