Практическое занятие № 1

Тема: Забор и хранение клинических образцов в ПЦР-лаборатории

Цель занятия: Освоить правила забора различных субстратов на ПЦР анализ.

Задачи:

1. Усвоить правило выделения ДНК из строго определенных субстратов (Таблица 1)

2. Освоить методику подготовки мочи, мокроты и слюнной жидкости к ПЦР анализу

3. Выучить основные правила безопасного поведения при работе в ПЦР-лаборатории.

Материалы и оборудование для проведения практического занятия.

1. Ламинарная система 2 класс защиты

2. Штативы с наконечниками, рабочие места для пробирок

3. Высокоскоростная микроцентрифуга «Minispin»

4. Микротермостат “Термит”

5. Микроцентрифуга-вортекс FV-2400

6. Пипетка-дозатор «Колор» (5-50 мкл; 20-200 мкл; 100-1000 мкл)

7. Насос с колбой-ловушкой

Ход работы:

1. Провести регистрацию образцов клинического материала

2. Взять клинический материал (мочу, мокроту, кровь) и провести подготовительные мероприятия к ПЦР анализу. При работе с мазками и секретом простаты использовать стерильные геникологические зонды (Рисунок 6).

3. Приготовить образец к транспортировке. Для транспортировки крови использовать пробирки с консервантом ЭДТА или цитратом Na (Рисунок 7)

Контрольные вопросы:

1. Как подготовить клинический материал для ПЦР-диагностики урогенитальных инфекций?

2. В каких условиях должны храниться пробирки без материала?

3. В каких условиях должны храниться пробирки с клиническим материалом?

4. Расскажите этапы работы с транспортировочной средой.

5. Какие рекомендации пациентам необходимо дать при заборе венозной крови для ПЦР анализа.

Таблица 1. Виды биологического материала для исследования методом ПЦР

Пцр диагностика. Пробоподготовка

ПЦР в диагностике инфекционных болезней

ПЦР - метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций "золотым стандартом", проверенный временем и тщательно апробированный клинически.

Достоинства метода ПЦР:

Среди методов диагностики инфекционных возбудителей, ПЦР обладает наиболее высокими показателями чувствительности (за счет экспоненциального накопления фрагментов ДНК) и специфичности (за счет выявления уникальных для микро-(макро)-организмов участков генетического материала).

Аналитическая чувствительность ПЦР-тест-систем для большинства вирусов и бактерий - 1000 микроорганизмов в 1 мл биологического материала. Специфичность ПЦР при использовании технологии для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%.

Возможность использования разнообразного клинического материала.

Возможность одновременного выявления нескольких микроорганизмов в одной биологической пробе, в отличие от бактериологических методов, где для разных возбудителей используются разные способы культивирования.

Простые требования к условиям хранения и транспортировки материала от пациента в лабораторию. Повышена стабильность при транспортировке до лаборатории, поскольку нет необходимости сохранять возбудителя в живом виде, в отличие от бактериологических и вирусологических методов.

Скорость проведения анализа: время получения результатов, для некоторых инфекций меньше, чем 24 часа.

Для некоторых микроорганизмов (например, Mycoplasma genitalium) ПЦР – единственный метод диагностики.

Но, несмотря на все достоинства ПЦР, преимущественное его использование для выявления инфекционного возбудителя применимо не ко всем микроорганизмам.

Так, например, для таких возбудителей как стафилококк или стрептококк лучше использовать микробиологический метод, а для диагностики бруцеллеза, бореллиоза, токсоплазмоза, краснухи, кори – целесообразнее использовать иммунологические методы (например, ИФА).

ИППП широко распространены во всем мире. К ним относятся: Бактерии - Возбудитель сифилиса (Treponema pallidum), Возбудитель гонореи (Neisseria gоnorrhoeae), Хламидия (Chlamydia trachomatis), Микоплазмы (Mycoplasma genitallium, Mycoplasma hominis), Уреаплазма (Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum). Вирусы ВИЧ (HIV), Генитальный герпес (HSV2), Папилломавирус (HPV). Простейшие- Трихомонада (Trichomonas vaginalis). Грибы - Возбудитель кандидоза (Candida spp.).

Большинство вышеперечисленных инфекций протекают со схожей симптоматикой, могут приобретать затяжное, хроническое течение, что приводит к развитию осложнений (воспалительные заболевания органов малого таза, нарушение репродуктивной функции, осложнения в процессе беременности и др.). Исходя из вышесказанного, совершенно очевидно, насколько важно своевременное выявление этих возбудителей.

ПЦР в диагностике ВИЧ-инфекции

В настоящее время для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции используется наиболее доступный и одновременно чувствительный подход - обнаружение в крови антител к ВИЧ с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) – anti-HIV (040601) с последующим подтверждением положительных результатов анализа методом иммуноблоттинга (ИБ). Эффективность выявления лиц, инфицированных ВИЧ, с помощью данного подхода может достигать 99% и более, что стало возможным благодаря разработке высокочувствительных и стандартизованных тест-систем для проведения ИФА и ИБ.

Однако наличие антител к ВИЧ в крови человека является лишь косвенным маркером ВИЧ-инфекции, поэтому неудивительно, что в некоторых случаях современная методология лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции может быть в сущности неинформативной. Так, известно, что в первые недели после заражения антитела к ВИЧ не могут быть выявлены методом ИФА по причине их отсутствия или низкой концентрации (период серологического «окна», который в среднем занимает от 2 до 6 месяцев). Описаны отдельные случаи ВИЧ-инфекции, когда специфические антитела не обнаруживались до 42 мес. с момента инфицирования. Кроме того, у пациентов в терминальном периоде заболевания концентрация антител к ВИЧ может значительно снижаться, что тоже приводит к ложноотрицательным результатам ИФА и ИБ.

С другой стороны, известно, что практически все тест-системы для ИФА могут давать ложноположительные результаты. Объясняют это явление присутствием в крови антител к антигенам, сходным с антигенами ВИЧ. Данная проблема решается путем дополнительного анализа всех положительных в ИФА сывороток методом ИБ. Однако при исследовании таких образцов, а также сывороток, полученных от ВИЧ-инфицированных пациентов во время сероконверсии (периода ВИЧ-инфекции, когда начинают вырабатываться антитела, но их количество еще не достаточно для выявления), не удается получить однозначные результаты ИБ. Согласно рекомендациям ВОЗ, сыворотки, дающие сомнительные результаты при применении метода ИБ, должны быть повторно исследованы с использованием наборов другой серии или другой фирмы. В случае повторного сомнительного результата рекомендуется наблюдение за пациентом в течение 6 мес. и повторное исследование сывороток через 3 мес. На практике это приводит к значительному удорожанию лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции, а также создает известные психологические проблемы для лиц, находящихся под таким наблюдением.

Эффективность тестирования на антитела к ВИЧ снижается практически до нуля при обследовании детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей. Показано, что в крови у незараженных детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей, антитела к ВИЧ могут обнаруживаться в течение продолжительного времени после рождения (до 1 года и более). С другой стороны, исчезновение антител к ВИЧ может быть вызвано гипоглобулинемией, являющейся следствием вызванного ВИЧ иммунодефицита, и поэтому не может быть основанием для снятия диагноза ВИЧ-инфекции. Поэтому такие дети должны находиться под наблюдением до 36 мес.

Перечисленные выше проблемы иммуноферментной диагностики ВИЧ-инфекции могут быть решены с помощью ПЦР.

Обнаружение ВИЧ методом ПЦР в крови возможно в двух вариантах:

Обнаружение ДНК провируса ВИЧ (032101) в мононуклеарных клетках периферической крови;

Обнаружение РНК ВИЧ (032102) в биологических жидкостях организма (например, в плазме или сыворотке крови).

Сейчас ПЦР на ДНК провируса ВИЧ используется как диагностическая методика для прямой диагностики ВИЧ-инфекции в следующих случаях:

В период серологического "окна". Хотя следует помнить! что чувствительность ПЦР на провирусную ДНК ВИЧ колеблется от 96 до 99%, в связи с чем, несмотря на высокие показатели чувствительности, ПЦР следует проводить или совместно с ИФА или с последующим подтверждением ИФА;

В случае сомнительного результата ИБ;

П ри обследовании детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей. Использование ПЦР в этом случае позволяет сократить сроки постановки диагноза ВИЧ-инфекции с 18 месяцев до 3-6 месяцев.

ПЦР на РНК ВИЧ используется для количественного измерения концентрации вируса в крови с целью прогноза и мониторинга уже установленной ВИЧ-инфекции.

Недостатки метода ПЦР

В настоящее время ПЦР, как диагностический тест, имеет определённые недостатки, которые можно выделить в две группы.

Первая - технологическая, подразумевающая под собой высочайшие требования к оснащению лаборатории, качеству тест-наборов и строжайшее соблюдение регламента исследования во избежание получения ложных результатов. Решение проблемы качества анализов возможно при соответствующей квалификации персонала и обязательной сертификации лаборатории. В связи с этим врачи должны требовать от лаборатории, проводящей исследования методом ПЦР государственный сертификат.

Вторая – клиническая, заключающаяся в неоднозначной прогностической оценке положительного результата ПЦР. Именно этот факт зачастую является необоснованным аргументом практических врачей для сомнения в полученном результате и эффективности метода ПЦР. Поясним на примере. Показано, что только у 40% - 60% лиц с обнаруженной в крови методом ПЦР ДНК цитомегаловируса клинически может развиться заболевание. В данной ситуации при оценке результатов исследования, совершается типичная ошибка, заключающаяся в отождествлении двух принципиально различных понятий – “инфицированность” и “инфекционная болезнь”.

Таким образом, недостатки ПЦР лежат не в сути метода, а в неправильном методическом подходе (алгоритме лабораторной диагностики) при обследовании пациента и неверной клинической интерпретации полученных результатов, на чём мы остановимся ниже.

В заключение необходимо отметить, что до сих пор идут споры о месте ПЦР в современной системе лабораторной диагностики инфекционных болезней. Однако, как мы попытались показать в настоящем обзоре, уже на данном этапе развития ПЦР является самым чувствительным и специфичным методом прямого обнаружения возбудителей, позволяющим не только устанавливать этиологию заболевания, но и осуществлять контроль за течением инфекционного процесса и оценивать эффективность проводимой терапии. Учитывая все вышесказанное, становится очевидным, что полимеразная цепная реакция является необходимым и обязательным методом обследования пациентов, и должна находиться в арсенале каждого врача, занимающегося инфекционной патологией.