Практическая работа №5

Тема: Аплификация образцов выделенной ДНК

Цель занятия: Освоить метод амплификации ДНК

Задачи:

1. Освоить теоретический курс условий проведения амплификации

2. Освоить технику программирования различных видов амплификаторов

3. Выучить основные технологические приемы подготовки проб к амплификации

Материалы и оборудование для проведения практического занятия.

1. Амплификатор «Терцик» с возможностью программирования и контро­­ля за процес­­сом без использования персонального компьютера. Предназначен для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) в клинико-диагностических и научных лабораториях (Рисунок 14).

2. ПЦР бокс БАВ-ПЦР- «Ламинар.-с»

3. Микроцентрифуга-вортекс FV-2400

4. Пипетка-дозатор «Колор» ( 0.5-10 мкл; 5-50 мкл (2 шт); 20-200 мкл; 100-1000 мкл)

5. Реакционная смесь, запечатанная парафином

6. Раствор Taq-полимеразы

7. Минеральное масло

8. Положительный контрольный образец (К+)  Положительный контроль позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение реакции. Для этого используют препарат ДНК, содержащий сайты для отжига праймеров: например, ДНК искомого микроорганизма или клонированные специфические участки его генома. Неспецифические ампликоны отличаются по размеру от ампликонов, образуемых в результате амплификации с контрольным препаратом ДНК. Они могут быть как большего, так и меньшего размера по сравнению с положительным контролем. В худшем случае их размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные.

Ход работы:

1. Промаркипуйте пробирки с запечатанной парафином реакционной смесью (с учетом пробирок для положительного контрольного образца- ПК и отрицательного контрольного образца- ОК)

2. Добавьте в каждую пробирку, не повреждая слой парафина, по 10 мкл тщательно перемешанного раствора Taq-полимеразы

3. Добавьте в каждую пробирку по 1 капле минерального масла

4. Перенесите пробирки в зону пробоподготовки

5. Добавьте в каждую пробирку, не повреждая слой парафина, по 0,5 мкл выделенного препарата ДНК (кроме пробирок ОК, ПК). В пробирку маркированную ОК, добавьте 5,0 мкл отрицательного контрольного образца, прошедшего пробоподготовку, в пробирку маркированную ПК, добавьте 5,0 мкл положительного контрольного образца.

6. Центрифугируйте пробирки при 1000 об\мин в течение 3-5 с

Таблица 2 Режим амплификации 1
Для амплификаторов с активным регулированием			Для амплификаторов без активного регули­ро­вания		Количес тво циклов
Температура	Время		Температура	Время
94°С '	1 мин 30 с		94°С	1 мин 30 с	1
94°С 64°С 72°С	20 с 5 с 5 с		94°С 64°С 72°С	50 с 50 с 50 с	5
94°С 64°С 72°С	5 с 5 с 5 с		94°С 64°С 72°С	50 с 50 с 50 с	40
10°С	хранение		10°С	хранение
Таблица 3 Режим амплификции 2
Для амплификаторов с активным регулированием		Для амплификаторов без активного регули­ро­вания			Количес тво циклов
Температура	Время	Температура		Время
94°С	1 мин 30	94°С		1 мин 30 с	1
94°С 67°С 72°С	20 с 5 с 5 с	94°С 67°С 72°С		50 с 50 с 50 с	5
94°С 67°С 72°С	5 с 5 с 5 с	94°С 67°С 72°С		50 с 50 с 50 с	40
10°С	хранение	10°С		хранение
Таблица 4 Режим амплификации 3
Для амплификаторов с активным регулированием			Для амплификаторов без активного регули­ро­вания		Количес тво циклов
Температура	Время		Температура	Время
94°С	1 мин 30		94°С	1 мин 30 с	1
94°С 67°С 72°С	20 с 5с 5 с		94°С 67°С 72°С	50 с 50 с 50 с	5
94°С 67°С 72°С	5 с 5 с 5 с		94°С 67°С 72°С	50 с 50 с 50 с	30
10°С	хранение		10°С	хранение

7. Установите все пробирки в амплификатор и проведите ПЦР в режиме, проведенном в таблицах, с учетом объема реакционной смеси 35 мкл. Соответствие режимов амплификации комплектам реагентов приведено в таблице 2.

Таблица 5 Режим амплификации 4

Для амплификаторов с активным регулированием		Для амплификаторов без активного регулирования		Количес тво циклов
Температ ура	Время	Температ ура	Время
94°С	1 мин 30 с	94°С	1 мин 30 с	1
94°С 62°С 70°С	20 с 10 с 10 с	94°С 62°С 70°С	50 с 50 с 50 с	5
94°С 64°С 70°С	5 с 5 с 5 с	94°С 64°С 70°С	50 с 50 с 50 с	40
10°С	хранение	10°С	хранение

Положительного контрольного образца (табл.5); в случае отсутствия специфической ДНК в образце (отрицательный образец) дорожка в геле пустая.

Условия хранения

Комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК следует хранить в темном месте при 2-8°С в течение всего срока годности.

Таблица 6 Длина продуктов ПЦР-амплификации

Продукт ПЦР-амплификации		Длина продукта амплификации , пар нуклеотидов		Длина внутреннего контроля, пар нуклеотидов
Режим амплификации 1
Хламидия трахоматис (Chlamidia trachomatis)		415		900
Микоплазма гениталиум (Mycoplasma genitalium)		440		900
Уреаплазма парвум (Ureaplasma parvum)		383		560
Уреаплазма уреалитикум (T-960)(Ureaplasma urealyticum)		206		560
Трихомонас вагиналис (Trichomonas vaginalis)		218		560
Нейссерия гонорреи (Neisseria gonorrhoeae)		329		560
Цитомегаловирус (CMV)		280		560
Вирус герпеса человека тип б (HHV6)		277		560
Вирус герпеса человека тип 8 (HHV8)		293		560
Вирус папилломы типы 51, 26 (HPV 51, 26)		520		-
Вирус папилломы типы 6, 11 (HPV 6, 11)		372		-
Бордетелла пертуссис (Bordetella pertussis)		419		-
Легионелла пневмофила (Legionella pneumophyla)		383		560
Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori)		348		560
Коринебактерия дифтерия (Corynebactehum diphtheriae) - токсигенные штаммы		251		560
Стрептококк группы A (Streptococcus pyogenes)		435		-
Токсоплазма гондии (Toxoplasma gondii)	250		560
Холерный вибрион (Vibrio cholerae) токсигенные штаммы	508
Вирус Эпштейна-Барр (EBV)	185		560
Вирус варицелла зостер (VZV)	250		560
Режим амплификации 2
Микоплазма хоминис (Mycoplasma hominis)	310		900
Уреаплазма уреалитикум (Т-960) и Уреаплазма парвум (Ureaplasma urealyticum+Ureaplasma parvum)	532		900
Кандида альбиканс (Candida albicans)	495		900
Вирус простого герпеса 1,2 (HSV-1,2)	261		900
Вирус папилломы тип 16 (HPV16)	349		-
Вирус папилломы тип 18 (HPV18)	433		-
Микобактерия туберкулеза- микобактерия бовис комплекс (М. Tuberculosis - М. Bovis)	330		900
Микобактерия туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis)	263		'
Режим амплификации 3
Гарднерелла вагиналис (Gardnerella vaginalis)	445		900
Режим амплификации 4
Вирус папилломы тип 16,31,33,35,35Н, 52,58,67 (HPV16,31,33,35,35H,52,58,67)	570/642*
Вирус папилломы тип 18,45,39,59 (НРУ 18,45,39,59)	285-297**		"

* - Для комплекта реагентов для ПЦР-амплификации ДНК HPV 16,31,33,35,35Н,52,58,67 при наличии в пробе ДНК HPV 33,58,67 продукт амплификации имеет длину 570 пар нуклеотидов, при наличии ДНК HPV 16,31,35,35Н,52 продукт имеет длину 642 пары нуклеотидов. В положительном контрольном образце ДНК амплифицируются оба продукта. ** - Для амлификационной системы HPV 18,45,39,59 продукты имеют близкие длины (HPV18 - 285, HPV45 - 291, HPV39 - 294, HPV59 - 297 пар нуклеотидов), разница между которыми при детекции не видна.

Контрольные вопросы:

1. Что называется амплификацией в ПЦР анализе?

2. Какие виды амплификаторов АВМ известны?

3. Покажите на амплификаторе «Терцик» работу компьютерного интерфейса и проведите заполнение протокола амплификации Кандиды альбиканс.

4. Какие этапы процесса амплификации вам известны?

ПЦР-АМПЛИФИКАЦИЯ С ДНК-ЗОНДАМИ ФЛУОРЕСЦЕНТНО МЕЧЕННЫМИ ДФ-520/560

Способ детекции продуктов амплификации основан на гибридизации олигонуклеотидных зондов (искусственно синтезированных участков ДНК) с продуктами амплификации, содержащими ту или иную метку, детектируемую специальными приборами. В этом случае чаще всего используют плашечный формат и систему детекции, аналогичную используемой в ИФА. Гибридизационные методы не получили пока широкого распространения из-за их дороговизны, длительности и трудоемкости методических манипуляций. Однако они интересны с точки зрения массового скрининга, т.к. при наличии соответствующего оборудования могут быть легко автоматизированы.

Конструкция гибридизационных зондов

• О лигонуклеотид: на одном конце присоединена флюоесцентная метка, на другом – гаситель

• Эффект переноса энергии (гашение флуоресценции)

• 5’-экзонуклеазная aктивность Taq-полимеразы расщепляет зонд

Преимущество флюоресцентной детекции – отсутствие контаминации

• Устраняется угроза конта­мина­ции специфичес­кими продуктами ПЦР

• Снижаются требования к организации процесса

• Снижаются вероятные субъективные ошибки

• Сокращается количество помещений

• Сокращаются трудозатраты и время анализа

• Автоматизация регистрации результатов