Практическая работа № 10

Тема: Реакция обратной транскрипции

Цель: Освоить методику постановки обратной транскрипции для получения кДНК

Задачи:

1. Подготовить стерильную посуду для постановки реакции

2. Используя полученный РНК образец провести реакцию обратной транскрипции

3. Используя кДНК поставить амплификацию для накопления кДНК гепатита С

Ход работы:

Материалы и оборудование

1. Амплификатор ДНК многоканальный «Терцик» 4х10х0.5 мл с независимым от компьютера управлением

2. ПЦР бокс БАВ-ПЦР- «Ламинар.-с»

3. Микроцентрифуга-вортекс FV-2400

4. Твердотельный теромостат Гном (Рисунок 12)

5. Пипетка-дозатор «Колор» ( 0.5-10 мкл; 5-50 мкл (2 шт); 20-200 мкл; 100-1000 мкл) Обратная транскриптаза

6. ОТ-буфер

7. Праймеры ОТ + дНТФ

1. Для проведения нескольких (N) реакций приготовьте ОТ-смесь: 2x(N + l) мкл ОТ-буфера, lx(N-H) мкл праймеров ОТ+дНТФ и 0,5x(N + l) мкл обратной транскриптазы.

2. Добавьте 3,5 мкл ОТ-смеси в пробирку с 16,5 мкл выделенной РНК и встряхните пробирку на вортексе в течение 3-5 сек.

3. Осадите капли центрифугированием пробирок при 1000 об/мин в течение 3-5 сек.

4. Термостатируйте пробирку в течение 30 мин при 40°С, а затем 5 мин при 95°С.

5. Осадите капли центрифугированием пробирок при 1000 об/мин в течение 3-5 сек.

Препарат ДНК готов к внесению в реакционную смесь для амплификации. Полученный препарат кДНК можно хранить в течение 6 месяцев при -20 С.

Препарат кДНК готов для внесения в реакционную смесь для амплификаци.

1. Для каждого генотипа промаркируйте по одной пробирке с запечатанной парафином реакционной смесью для отрицательных (ОК) и положительных (ПК) контрольных образцов.

2. Для каждого препарата кДНК промаркируйте по б пробирок с запечатанной парафином реакционной смесью.

3. По количеству промаркированных пробирок (N), включая положительные и отрицательные контрольные образцы, приготовьте смесь ПЦР-буфера с Taq-полимеразой: 10x(N + l) мкл ПЦР-буфера и 0,5x(N + l) мкл Taq-полимеразы.

4. В каждую промаркированную пробирку внесите по 10 мкл смеси ПЦР-буфера с Taq-полимеразой.

5. В каждую промаркированную пробирку внесите по 20 мкл минерального масла (приблизительно 1 капля из наконечника на 200 мкл).

6. В каждую промаркированную пробирку внесите по 5 мкл соответствующего препарата кДНК, отрицательного или положительного контрольного образца.

Примечание. Чтобы избежать повреждения парафинового слоя масло, препараты кДНК, ПК и ОК рекомендуется наносить на внутреннюю стенку пробирки.

7. Осадите капли со стенок пробирок центрифугированием в течение 1-3 сек при 3-5 тыс. об. /сек.

8. Поместите пробирки с подготовленной реакционной смесью в амплификатор. Для проведения амплификации используйте программу, приведенную в табл. 1.

9. Проведение детекции и учет результатов ПЦР

10. По окончании реакции амплификации результаты анализируют методом горизонтального гель-электрофореза (см. инструкцию к комплекту реагентов для детекции продуктов ПЦР методом гель-электрофореза).

11. Продукт амплификации виден в ультрафиолетовом свете (длина волны 254 нм или 310 нм) в виде светящейся полосы ДНК красно-оранжевого цвета.

Таблица 11

Для амплификаторов с активным регулированием		Для амплификаторов без активного регулирования
Температура	Время	Температура	Время	Кол-во повторов
94°С	1 мин 30 сек	94°С	1 мин 30 сек	1
94°С 64°С 72°С	20сек 5 сек 5 сек	94°С 64°С 72°С	50сек 50сек 50сек	10
94°С 64°С 72°С	5 сек 5 сек 5 сек	95°С 64°С 72°С	50сек 50сек 50сек	35
10°С	хранение	10°С	Хранение

1. В пробирках, маркированных как положительные контроли (ПК), должна быть видна светящаяся полоса красно-оранжевого цвета, содержащая фрагменты ДНК определенного генотипа HCV соответствующего размера (таблица 2). Помимо этого в ПК может присутствовать светящаяся полоса внутреннего контроля (ВК), соответствующая 900 п.о.

Таблица 12

	Генотип HCV	Длина продукта амплификации, п.о.
HCV	общий	153
	1а	278
	lb	215
	2а	262
	2Ь	371
	3	212
ВК		900

2. В пробирках, маркированных ОК, должна присутствовать одна светящаяся полоса красно-оранжевого цвета размером 900 п.о., соответствующая ВК. Наличие полосы красно-оранжевого цвета размером, соответствующим продукту амплификации для данного ге­но­типа, свидетельствует о контаминации. В этом случае результаты реакции признают недостоверными.

3. В исследуемых пробирках, в которых образовался только продукт амплификации ВК, результат реакции признают отрицательным. Если продукт амплификации ВК не образовался, результат реакции признают недостоверным.

4. При наличии светящейся полосы красно-оранжевого цвета на уровне положительного контрольного образца результат реакции признают положительным. В этом случае наличие или отсутствие светящейся полосы ВК, в учет не принимают.

5. Наличие светящихся полос, не соответствующих по электрофоретической подвижности ПК или ВК, рассматривается как отрицательный результат и является следствием неспецифической амплификации или контаминации.

Необходимо учитывать, что для вируса гепатита С характерен высокий полиморфизм, обуславливающий большое разнообразие генотипов, субтипов и вариаций. Помимо предложенных в данном наборе могут встречаться смешанные или другие генотипы. Надежным критерием получения достоверного результата является выявление РНК вируса гепатита С, которое при отсутствии положительных результатов с генотипирующими праймерами свидетельствует о наличии редкого генотипа.

Приложение 1.