Практическая работа №8

Тема: Детекция ДНК методом гель-электрофорез

Цель занятия: Освоить метод детекции с помощью методом гель-электрофорез

Задачи:

1. Усвоить правило подготовки ДНК образца к детекции методом гель-электрофорез

2. Освоить теоретические основы реализации метода детекции методом гель-электрофорез

3. Приготовить самостоятельно гель и буфер для электорфорезной детекции

4. Выучить основные правила безопасного поведения при детекции методом гель-электрофорез

М атериалы и оборудование для проведения практического занятия.

1. Ламинар типа «ПЦР-бокс»

2. Трансиллюминатор (Рисунок 23)

3. Камера для электрофореза

4. Видео-система GelImager для документации результатов электрофореза, программное обеспечение

5. Источник питания (программируемый) «ЭЛЬФ-4»

6. Дозаторы HTL «VE-series»

7. Штатив для дозаторов

8. Штатив рабочее место 200X0,5мл.

9. Буфер для гелей

10. Агароза

11. Краска для электрофореза

12. Буфер для э/ф

Реактивы комплекта содержат токсичный компонент бромистый этидий. Все работы с комплектом реагентов необходимо проводить в резиновых перчатках и халате.

Ход работы № 1:

1. Приготовьте буфер для гелей, растворив содержимое пакета с надписью "Буфер для гелей" в 200 мл дистиллированной воды, тщательно перемешайте.

2. Добавьте в приготовленный буфер для гелей агарозу и нагревайте до полного растворения в микроволновой печи.

3. Остудите примерно до 50°С и добавьте краску для электрофореза, тщательно перемешайте до равномерного распределения краски.

4. Установите гребенки и залейте гели, дождитесь полного застывания гелей (примерно 40 мин при температуре 22°С) и снимите гребенки.

5. Приготовьте буфер для электрофореза, растворив содержимое пакета с надписью «буфер для э/ф» в 1 л дистиллированной воды. Приготовленный буфер для электрофореза можно хранить 7 дней при комнатной температуре (18-25°С) или 1 мес при температуре 2-8°С.

6. Заполните камеру для электрофореза буфером для электрофореза.

7. Поместите пластину с агарозным гелем в камеру для электрофореза. Буфер для электрофореза должен покрывать пластину с гелем слоем приблизительно в 5 мм. При работе с агарозным гелем следует обязательно надевать резиновые перчатки!

8. Внесите по 7 мкл продукта амплификации в соответствующие лунки агарозного геля под буфера

Примечание: при нанесении продукта амплификации допускается использование одного наконечника, в этом случае необходимо промывать наконечник водой после нанесения каждого образца (путем многократного пиппетирования воды). При анализе продуктов ПЦР из пробирок, запечатанных парафином, рекомендуется использовать пипетки для наконечников с поршнем.

9. Установите крышку на камеру для электрофореза и подключите источник постоянного тока. Электрофорез проводите при напряжении 20 В/см геля в течение 10 мин (при ширине камеры 10 см напряжение, устанавливаемое в источнике постоянного тока, должно быть приблизительно равно 200 В).

10. После окончания электрофореза отключите источник постоянного тока, снимите крышку с камеры. В резиновых перчатках выньте пластину с агарозным гелем из камеры для электрофореза, снимите гель с пластины и поместите на экран трансиллюминатора. Наденьте защитную маску или установите защитный экран, включите трансиллюминатор.

Учет результатов ПЦР-амплификации ДНК проводите согласно инструкции к комплекту реагентов для ПЦР-амплификации ДНК.

Ход работы № 2:

Материалы и оборудование для проведения практического занятия

1. Л аминар типа «ПЦР-бокс»

2. Трансиллюминатор (Рисунок 24 № 3)

3. Камера для электрофореза (Рисунок 24 № 2)

4. Видео-система GelImager для документации результатов электрофореза, программное обеспечение(Рисунок 24 № 4)

5. Источник питания (программируемый) «ЭЛЬФ-4» (Рисунок 24 № 1)

6. Дозаторы HTL «VE-series» (Рисунок 24 № 5)

7. Штатив для дозаторов(Рисунок 24 № 6)

8. Штатив рабочее место 200X0,5мл.

9. Буфер для гелей

10. Агароза

11. Краска для электрофореза

12. Буфер для э/ф

13. Агарозный гель (1,6%)

1. Приготовьте буфер для электрофореза, растворив содержимое пакета с надписью «буфер для э/ф» в 1 л дистиллированной воды. Приготовленный буфер для электрофореза можно хранить 7 дней при комнатной температуре (18-25°С) или 1 мес при температуре 2-8°С.

2. Заполните камеру для электрофореза буфером для электрофореза.

3. Поместите пластину с агарозным гелем в камеру для электрофореза. Буфер для электрофореза должен покрывать пластину с гелем слоем приблизительно в 5 мм. При работе с агарозным гелем следует обязательно надевать резиновые перчатки!

4. Внесите по 7 мкл продукта амплификации в соответствующие лунки агарозноо геля под буфер.

5. Примечание: при нанесении продукта амплификации допускается использование одного наконечника, в этом случае необходимо промывать наконечник водой после нанесения каждого образца (путем многократного пиппетирования воды). При анализе продуктов ПЦР из пробирок, запечатанных парафином, рекомендуется использовать пипетки для наконечников с поршнем.

6. Установите крышку на камеру для электрофореза и подключите источник постоянного тока. Электрофорез проводите при напряжении 20 В/см геля в течение 10 мин (при ширине камеры 10 см напряжение, устанавливаемое в источнике постоянного тока, должно быть приблизительно равно 200 В).

7. После окончания электрофореза отключите источник постоянного тока, снимите крышку с камеры.

8. В резиновых перчатках выньте пластину с агарозным гелем из камеры для электрофореза, снимите гель с пластины и поместите на экран трансиллюминатора. Наденьте защитную маску или установите защитный экран, включите трансиллюминатор.

9. Учет результатов ПЦР-амплификации ДНК проводите согласно инструкции к комплекту реагентов для ПЦР-амплификации ДНК.