Практическое занятие №4

Т ема: Выделение ДНК из мочи, секрета простаты, слюны, глазной жидкости

Цель занятия: Освоить метод выделения ДНК из мочи и мазков на основе ионообменных процессов типа Chilex .

Задачи:

1. Усвоить правило выделения ДНК из мочи и мазков методом на основе на ионнобменных процессов типа Chilex (Таблица 1) .

2. Освоить методику подготовки мочи и мазков к ПЦР анализу.

3. Выучить основные правила безопасного поведения при работе в ПЦР-лаборатории

4. Освоить методику выделения ДНК основанной на использовании ионообменников типа Chilex.

Материалы и оборудование для проведения практического занятия.

1. Амплификатор ДНК многоканальный «Терцик» 4х10х0.5 мл с независимым от компьютера управлением

2. П ЦР бокс БАВ-ПЦР- «Ламинар.-с» Микроцентрифуга-вортекс FV-2400

3. Твердотельный теромостат Гном (Рисунок 12)

4. Пипетка-дозатор «Колор» ( 0.5-10 мкл; 5-50 мкл (2 шт); 20-200 мкл; 100-1000 мкл)

5. Лизирующий раствор

6. Буфер для лизиса

7. Сорбент

Ход работы:

Метод предназначен для работы с урогенитальными мазками, культурами клеток, водой и т.д. Непригоден для работы с образцами с примесью крови или большого количества ингибиторов. Метод основана на использовании ионообменников типа Chilex, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а примеси, ингибирующие ПЦР. Метод привлекает простотой выполнения и технологичностью, позволяет свести к минимуму риск перекрестной контаминации от образца к образцу.

Следует отметить, что при использовании этого метода пробоподготовки возможно ингибирование ПЦР вследствие присутствия посторонних примесей в полученном препарате ДНК. При работе с урогенитальными мазками встречается приблизительно 30% образцов, в которых присутствуют вещества, ингибирующие ПЦР. Как правило, эффект ингибирования можно наблюдать лишь при низких концентрациях искомой ДНК. Таким образом, количество образцов, дающих ложно-отрицательный результат при использовании метода не превышает 5%.

1. Центрифугируйте пробирку, содержащую анализируемый материал, в течение 10 мин при 13000 об/мин. При работе с ректальными мазками или материалом, содержащим большое количество примесей, необходимо промыть осадок физраствором 2-3 раза.

2. Удалите надосадочную жидкость, оставив в пробирке 25-30 мкл (осадок + жидкая фракция).

Внимание! Одновременно с выделением ДНК из биологического материала необходимо провести пробоподготовку отрицательного контрольного образца (ОК). Для этого в отдельную пластиковую пробирку объёмом 1,5 мл внесите 30 мкл физиологического раствора стерильного и выполните пп.3-10 настоящей инструкции.

3. Приготовьте лизирующую смесь: для обработки нескольких образцов с учётом ОК (N), смешайте в отдельной пробирке 25х(N+1) мкл буфера для лизиса и 0,5х(N+1) мкл лизирующего раствора.

4. Добавьте по 25 мкл лизирующей смеси в каждую пробирку с образцом и встряхните пробирку на вортексе в течение 3-5 с.

5. Центрифугируйте пробирку при 1000 об/мин в течение 3-5 с.

6. Термостатируйте пробирку в течение 30 мин при 65 °С.

7. Центрифугируйте пробирку при 1000 об/мин в течение 3-5 с.

8. Добавьте 50 мкл предварительно ресуспендированного сорбента в пробирку с образцом и встряхните

пробирку на вортексе в течение 5-10 с.

9. Термостатируйте пробирку в течение 20 мин при 95 °С.

10. Центрифугируйте пробирку при 13000 об/мин в течение 1 мин.

Надосадочная жидкость, содержащая выделенную ДНК, готова к внесению в реакционную смесь для ПЦР-амплификации.

Контрольные вопросы:

1. Какие мероприятия санитарно-гигиенической обработке помещения необходимо соблюдать в боксе пробоподготовки?

2. Расскажите технику взятия слезной жидкости на ПЦР анализ

3. Как влияют на выделение ДНК посторонние примеси в образце?

4. Можно ли выделять ДНК возбудителя уреаплазмы (Ureaplasma urealyticum) из мазка и мочи?

ПЦР –АМПЛИФИКАЦИЯ

Если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в процессе реакции амплификации с ней происходит ряд событий, обеспечиваемых определенными температурными циклами. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов:

 1.  Денатурация. На первом этапе необходимо расплести двойную цепь ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95°С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.

 2.  Отжиг. На втором этапе праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Этот процесс носит название "отжиг" (от англ. "annealing").

Праймеры подбирают так, что они ограничивают (фланкируют) искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК.

Отжиг происходит в соответ­ст­вии с правилом комплементарности Чаргаффа, означаю­щим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аде­нина всегда находится тимин, а напротив гуанина – ци­тозин. Если это условие не соблюдено, то отжига прай­­меров не происходит.

После отжига праймеров Taq-по­лимераза начинает достраивание второй цепи ДНК с 3 '-конца праймера.

 3. Элонгация (синтез). На третьем этапе температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы, и синтез второй цепи продолжается с максимальной эффективностью.

Иногда, в случае близкого значения температуры отжига праймеров и температуры оптимума работы фермента, становится возможным использовать двухэтапный ПЦР, совместив отжиг и элонгацию.

Температурный цикл амплификации многократно повторяется (30 и более раз). На каждом цикле количест

Рисунок 13. Схема основных этапов ПЦР анализа.

во синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается.