Практическое занятие №3

Тема: Выделение ДНК на сорбент из крови

Цель занятия: Освоить метод выделения ДНК из крови с помощью сорбента.

Задачи:

1. Усвоить правило выделения ДНК на сорбент из строго определенных субстратов (Таблица 1)

2. Освоить методику подготовки крови к ПЦР анализу

3. Выучить основные правила безопасного поведения при работе в ПЦР-лаборатории

4. Освоить методику выделения ДНК на сорбент из крови

Метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента (GuSCN), и последующей сорбции ДНК на носителе-сорбенте (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко»). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего раствора. Метод удобен, технологически и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носители, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение имеет при работе с небольшим количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые концентрации GuSCN могут ингибировать ПЦР. Потому при использовании этого метода очень важно тщательное соблюдение технологических нюансов. Следует отметить, что из-за большого количества стадий добавление и удаление растворов при работе с образцом требуется аккуратность, т.к. возможна перекресная контаминация между пробами образующейся аэрозолью ДНК.

Внимание! На Рисунке 10 изображены основные виды манипуляций, которые используются при выделении ДНК. Необходимо отметить, что каждая манипуляция имеет определенную временную продолжительность, температурный режим и режим ускорения при центрифугировании. Используя ниже приведенную схему, на примере с чистой пробиркой, провидите все 6 манипуляций.

Рисунок 10. Основные манипуляции при выделении ДНК из всех видов субстрата

Ход работы:

Материалы и оборудование для проведения практического занятия.

1. Амплификатор ДНК многоканальный «Терцик» 4х10х0.5 мл с независимым откомпьютера управлением

2. ПЦР бокс БАВ-ПЦР- «Ламинар.-с»

3. Микроцентрифуга-вортекс Lab dancer (Рисунок 11)

4. Пипетка-дозатор «Колор» ( 0.5-10 мкл; 5-50 мкл (2 шт); 20-200 мкл; 100-1000 мкл)

5. Лизирующий раствор (Tris Cl, pH 8.0; NaCl; SDS; Triton X-100; EDTA; H₂O)

6. Сорбент (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко»)

7. Промывочный раствор №1

8. Промывочный раствор №2

9. Промывочный раствор №3

10. Элюирующий раствор ДНК

Рисунок 11. Микроцентрифуга- вортекс Lab dancer

Комплект реагентов предназначен для получения препарата нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) из плазмы крови с использованием сорбента.

1. Пробирку содержащую анализируемы материал, центрифугируйте в течение 10 мин при 14000 об\мин

2. Удалите надосадочную жидкость, оставив в пробирке примерно 50 мкл (осадок+ жидкая фракция)

3. Для обработки нескольких (N) образцов смешайте в отдельной пробирке 150х(N+1) мкл лизирующего раствора и 20х(N+1) предварительно ресуспендированного сорбента

4. Добавьте по 170 мкл полученной смеси в каждую пробирку с образцом и встряхните пробирку на вортексе в течении 3-5 сек.

5. Термостатируйте пробирки в течение 20 мин при Т=50⁰С

6. Центрифугируйте пробирку в течение 1 мин при 14000 об\мин

7. Удалите надосадочную жидкость

8. Добавьте к осадку 200 мкл промывочного раствора №1 и встряхните пробирку на вортексе в течении 3-5 сек.

9. Центрифугируйте пробирку в течение 1 мин при 14000 об\мин

10. Удалите надосадочную жидкость

11. Добавьте к осадку 200 мкл промывочного раствора №2 и встряхните пробирку на вортексе в течении 3-5 сек.

12. Центрифугируйте пробирку в течение 1 мин при 14000 об\мин

13. Удалите надосадочную жидкость

14. Добавьте к осадку 200 мкл промывочного раствора №3 и встряхните пробирку на вортексе в течении 3-5 сек.

15. Центрифугируйте пробирку в течение 1 мин при 14000 об\мин

16. Удалите надосадочную жидкость

17. Откройте крышку пробирки и термостатируйте 5 мин при Т=50⁰С

18. Добавьте к осадку 100 мкл элюирующего раствора и встряхните пробирку на вортексе в течении 3-5 сек.

19. Термостатируйте пробирки в течение 5 мин при Т=50⁰С

20. Центрифугируйте пробирку в течение 1 мин при 14000 об\мин. Если образец предполагается хранить, перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку.

Надосадочная жидкость содержит выделенную ДНК, готова для внесения в реакционную смесь для ПЦР-амплификации.

Контрольные вопросы:

1. Расскажите о достоинствах ПЦР диагностики

2. Какие недостатки ПЦР диагностики?

3. Какие возможности открыл ПЦР анализ при диагностики гепатитов?

4. Какие преимущества имеет ПЦР анализ в диагностике ВИЧ-инфекции?

5. Как методически отличается процедура выделения ДНК возбудителя с тест-системами на основе сорбента и ферментативного выделения?