Кривые плавления

Для этого после окончания ПЦР реакционную смесь нагревают и непрерывно измеряют флуоресценцию. По достижении температуры плавления продукта амплификации флуоресценция резко снижается.

Каждое резкое уменьшение флуоресценции на графике соответствует числу полосок, получаемых на электрофорезе, то есть числу разных типов ампликонов. Для облегчения работы с полученной информацией проводят дифференциальный анализ кривой плавления. Такой способ визуализации полученных данных гораздо удобнее для понимания и анализа.

Применение кривых плавления не ограничивается только детекцией продуктов амплификации с помощью бромистого этидия и SYBR Green I. При использовании кривых плавления в системах с ДНК-зондами (Taq-man assay, beacons) возможно различать точечные мутации, расположенные внутри областей связывания ДНК-матрицы и зонда. Наличие таких мутаций способно привести к изменению температуры плавления зонда и к изменениям в графике кривой плавления [1]. Использование кривых плавления не требует от оператора амплификатора никаких дополнительных манипуляций с пробирками, а интерпретация полученных данных автоматизирована и формализована.

Подводя итоги стоит отметить следующее: использование ДНК-зондов в том или ином варианте является наиболее предпочтительным в свете повышения специфичности анализа. Однако к недостаткам зондов относится высокая стоимость, что делает работу по подбору зондов, праймеров и условий амплификации дорогостоящей. Вместе с тем, использование интеркалирующих агентов является очень простым и дешевым. Отпадает необходимость подбора специальных праймеров, зондов, так как можно пользоваться уже используемыми праймерами, эффективность работы которых уже проверена. Эти обстоятельства делают применение интеркалирующих агентов весьма привлекательным.

В настоящее время создана научная и материально-техническая база для широкого внедрения в клиническую лабораторную диагностику новой генодиагностической технологии - количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов - ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). В ближайшие годы данная технология будет применяться в гепатологии (вирусные гепатиты В и С), в клинике ВИЧ и ВИЧ-ассоциированных инфекций (в первую очередь герпетическая и цитомегаловирусная инфекции), в дерматовенерологии, фтизиатрии, гастроэнтерологии, пульмонологии. С помощью ПЦР в реальном времени будет оцениваться эффективность проводимой терапии и клинический прогноз заболевания.

Приборное обеспечение реакций амплификации

Важным фактором воспроизводимости реакции амплификации является приборное обеспечение. Кроме надежности амплификатора и точности поддержания температур следует упомянуть о таком важном качестве прибора, как использование "активного регулирования", позволяющего добиваться достижения нужной температуры реакционной смеси внутри пробирки в значительно более короткие сроки, чем при обычном регулировании. Тем самым, сокращается время реакции (в 1,5-2 раза); увеличивается время сохранения активности Taq-полимеразы, что позволяет увеличить количество циклов амплификации, снизить риск неспецифического отжига праймеров, а следовательно, повысить чувствительность и специфичность реакции.

К приборам такого класса следует отнести модели амплификаторов "PCR - System 2400" или "Model 9600" (Perkin-Elmer, США), "TouchDown" (HyBaid, Великобритания), "РТС 200" (MJ Research, США), "Терцик" (НПФ ДНК-Технология, Россия). При использовании приборов с "активным регулированием" следует учитывать тип ПЦР-пробирок и строго придерживаться рекомендаций фирм-изготовителей. Это объясняется тем, что при высоких скоростях изменения температуры минимальные отличия в конфигурации гнезд амплификатора и формы конуса ПЦР-пробирки могут сводить на нет преимущества "активного регулирования" и приводить к снижению чувствительности реакции из-за температурных погрешностей, связанных с ухудшением теплового контакта.

Термоциклер Gradient Palm Cycler

C orbett Research кардинально изменила программируемый интерфейс современного термоциклера, сохраняя при этом все возможности оборудования высочайшего класса. Программное обеспечение загружается в микрокомпьютер типа Palm, интегрированный в термоциклер, обеспечивая непревзойденное качество пользовательского интерфейса. Сам Palm может быть отсоединен от самого прибора, что позволяет связывать амплификатор с удаленным территориально пользователем. Модернизированное программное обеспечение можно легко загружать из Интернета с веб-сайта фирмы-производителя

Новая модель iCycler IQ реал-тайм

В 2005 году Био-Рад выпустил новую модель самого популярного в России амплификатора для ПЦР в реальном времени.

Н овый iQ 5 iQ установлено в РФ более 70 машин

Детектирующий амплификатор «ДТ-322».

Прибор для проведения количественного ПЦР-анализа с детекцией результатов в режиме «реального времени». Детектирующий амплификатор «ДТ-322».

Амплификационный блок "ДТ-322" состоит из двух отдельно термостатируемых половин, по 16 лунок в каждой. Вы можете запустить 2 схожих программы амплификации (например, отличающихся только температурой отжига праймера) одновременно на левой и правой половинах блока (реально запускается одна программа, где оператор указывает свои температуры "полок" для левой и правой половин блока). При этом все пробирки на каждой половине блока будут в совершенно одинаковых условиях (градиента температур по блоку не будет). На любой из частей блока нельзя запустить вторую программу амплификации, когда одна программа уже запущена.