4 курс / Акушерство и гинекология / Егорова_Е_С_Основные_принципы_ведения_беременных_с_анемией_и_тромбофилией

Ниже приводится алгоритм процедуры определения ВА при использовании разных фосфолипидзависимых скринирующих тестов

(рис. 8).

Мы считаем крайне важным правильную интерпретацию результатов исследования и исключение ложноположительных результатов. Поэтому необходимо учитывать, что

1) удлинение АЧТВ и каолинового времени может быть при:

-приеме прямых и непрямых антикоагулянтов;

-дефиците факторов внутреннего пути свертывания;

-циркуляции специфических и неспецифических антикоагулянтов;

-дефиците витамина К как следствия мальабсорбции и длительной антибиотикотерапии;

-механической желтухе;

-коагулопатии потребления;

-гиперфибринолизе.

Рисунок 6. Алгоритм определения ВА.

а) с использованием АЧТВ

АЧТВ удлинено Тромбиновое время

подтверждающая проба с фосфолипидами

60

б) помощью времени разведенного яда гадюки Рассела (dRVVT) dRVVT удлинено

коррекционная проба

подтверждающая проба с фосфолипидами

нет коррекции коррекция

ингибитор фактора V волчаночный антикоагулянт

2) удлинение dRVVT может быть при:

-циркуляции ВА;

-циркуляции ингибитора фактора V;

-дефиците факторов V, Х и I;

-приеме прямых и непрямых антикоагулянтов.

3) удлинение протромбинового времени в тесте с разведенным тромбопластином может быть при:

-приеме прямых и непрямых антикоагулянтов;

-дефиците факторов внешнего пути свертывания;

-циркуляции специфических и неспецифических антикоагулянтов;

-дефиците витамина К;

-механической желтухе;

-коагулопатии потребления.

Также проводилось определение концентрации АФА (IgA, IgG, IgM)

иммуноферментным методом (Stago, Asserachrom APA). Средние титры – 20-40 GPlU/ml; высокие - 40.

7. Всем пациенткам с выявленной мутацией МТHFRС677Т

проводилось определение концентрации гомоцистеина в плазме крови,

61

иммуноферментным методом с использованием реактивов Axis® фирмы AxisShield AS, Норвегия на приборе ANТОS 2020, США (табл. 11).

Таблица 11. Определение степени гипергомоцистеинемии.

8.Глобальная оценка функционирования системы протеина С осуществлялась коагулометрическим методом с использованием коммерческих наборов «Парус»-тест фирмы «Технология-Стандарт», Барнаул, Россия на приборе «START 4» (Stago, Франция).

9.Уровни PAI-1, АТ III и протеина С определялись методом синтетических хромогенных субстратов Stago, Франция на спектрофотометре с длиной волны

405 нм на приборе ST 88 Diagnostica Stago.

10. Выявление генетически обусловленных форм тромбофилии Молекулярный анализ генетических дефектов гемостаза FV Leiden

/1691G-A/, мутации гена фолатзависимого фермента метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFR C677T, а также мутация в гене Pt G20210A выполнялась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Основные этапы выявления генетических дефектов гемостаза включали: -выделение ДНК;

-амплификацию (методом ПЦР);

-рестрикцию.

Молекулярный анализ генетических дефектов FVLeiden /1691G-A/,

MTHFRC677T, Pt G20210А выполнялся постановкой полимеразной цепной

реакции. Этот метод амплификации ДНК in vitro обеспечивает выявление

62

даже незначительных изменений в генах. Принцип ПЦР заключается в циклической денатурации с образованием матричных цепей, гибридизации олигонуклеотидов, комплементарных синтезируемой ДНК и пр.

1.Определение мутации в гене С677Т в гене 5,10-

метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) человека методом ПЦР.

Мутация С677Т в гене MTHFR человека представляет собой замену остатка цитозина в положении 677 на остаток тимина.

В результате мутации изменяется последовательность аминокислот полипептидной цепи фермента, что делает его термолабильным, приводит к дефициту цитоплазматической MTHFR и повышению уровня гомоцистеина в плазме крови из-за подавления его метаболизма. С помощью ПЦР производится амплификация участка ДНК обследуемого пациента,

изменяемого под действием мутации. При этом содержание амплифицируемого фрагмента ДНК в пробе увеличивается в ~108 раз по сравнению с исходным. Процесс амплификации совершается при повторных циклах температурной денатурации ДНК, отжига олигонуклеотидных праймеров на комплементарных последовательностях ДНК и последующей достройке полинуклеотидных цепей с этих праймеров термостабильной ДНК-полимеразой. Мутация С677Т приводит к образованию нового сайга рестрикции для рестриктазы HinfI. Поэтому рестриктаза может расщеплять в этом месте мутантный, но не нормальный продукт ПЦР. По окончании ПЦР образовавшийся фрагмент ДНК инкубируют с рестриктазой HinfI и продукты реакции анализируют электрофорезом в агарозном геле. При наличии мутации обнаруживают образование двух низкомолекулярных полос,

образовавшихся под действием фермента. При этом полное расщепление продукта ПЦР свидетельствует о наличии в анализируемой ДНК гомозиготной формы мутации C677Т, а частичное - гетерозиготной (рис. 8).

Продукты ПЦР становятся видимыми в 3% агарозном геле после прокрашивания бромистым этидием благодаря их флюоресценции в ультрафиолетовом свете. В результате полимеразной цепной реакции (38

63

циклов) образуется фрагмент ДНК длинной 205 нуклеотидных пар.

Инкубация продукта ПЦР с рестриктазой HinfI не сопровождается его расщеплением при отсутствии мутации С677Т (дорожки 2 и 5 рис. 9), полное расщепление с образованием фрагментов ДНК длиной 116 и 79 пар нуклеотидов (дорожка 8), происходит при наличии гомозиготной формы мутации и при гетерозиготной мутации - частичное ращепление (дорожки 1,

3, 4, 6, 7, 9).

Рисунок 7. Молекулярный анализ мутации MTHFRC677T.

2. Определение мутации в гене фактора V Leiden свертывающей системы крови методом полимеразной цепной реакции.

Мутация Leiden в гене фактора V представляет собой замену остатка аденина в положении 1691 на остаток тимина. В результате мутации происходит замена Arg-506 Gln в полипептидной цепи FV. В результате ПЦР амплифицируется участок исследуемой ДНК, измененный под действием мутации. Мутация Leiden нарушает сайт рестрикции для рестриктазы Мп1. Поэтому рестриктаза может расщеплять в этом месте нормальный, но не мутантный продукт ПЦР. По окончании ПЦР образовавшийся фрагмент ДНК инкубируют с рестриктазой Мп1. При отсутствии мутации после электрофореза обнаруживают две низкомолекулярные полосы, образовавшиеся под действием фермента.

Полная устойчивость продукта ПЦР к рестриктазе свидетельствует о

64

наличии в анализируемой ДНК гомозиготной мутации, а частичная – гетерозиготной формы (рис. 10).

Продукты ПЦР обнаруживаются в 3% агарозном геле после прокрашивания бромистым этидием по флюоресценции в ультрафиолетовом свете. При проведении ПЦР в пробах, содержащих ДНК человека, образуется фрагмент ДНК длинной 205 нуклеотидных пар. Инкубация продукта ПЦР с рестриктазой MnI сопровождается его полным расщеплением при отсутствии мутации Leiden. Расщепление отсутствует при наличии гомозиготной формы

(дорожки 3 и 5, рис. 10), при гетерозиготной форме мутации – частичное расщепление (дорожки 7 и 13).

Рисунок 8. Молекулярный анализ мутации FVLeiden /1991G-A/.

3. Определение мутации G20210А в гене протромбина методом полимеразной цепной реакции.

Мутация PtG20210А представляет собой замену остатка гуанина в положении 20210 на остаток аденина, локализованного в его концевой некодирующей части. В результате мутации не изменяется последовательность аминокислот полипептидной цепи протромбина, однако увеличивается стабильность его м-РНК, что сопровождается повышением уровня синтеза протромбина и его концентрации в плазме крови. Мутация

PtG020210А нарушает в ПЦРпродукте искусственный сайт рестрикции для рестриктазы Таq I, недостающие нуклеотиды которого вводятся в ПЦР-

продукт с помощью одного из праймеров. Поэтому рестриктаза может

65

расщеплять в этом месте нормальный, но не мутантный амплифицированный фрагмент ДНК. При наличии гомозиготной мутации исходный продукт ПЦР не расщепляется ферментом. Полное расщепление продукта ПЦР свидетельствует об отсутствии мутации PtG20210А в анализируемой ДНК, а

частичное - гетерозиготной формы мутации (рис. 11).

Продукты ПЦР обнаруживают в 4% агарозном геле после прокрашивания бромистым этидием по флюоресценции в ультрафиолетовом свете.

Хотя в мировой практике описывается гомозиготная форма мутации

PtG20210А, нами были выявлены преимущественно гетерозиготные формы.

Инкубация продукта ПЦР с рестриктазой TaqI сопровождается его полнымрасщеплением пр отсутствии мутации, частичным при наличии гетерозиготной мутации(дорожки 1,4 и 8).

Рисунок 9. Молекулярный анализ мутации PtG20210A.

В процессе ПЦР-диагностики полиморфизма GP Ia использовалась рестриктаза HinfI, GP IIIa «1565 Т/С» - MspI, фибриногена «455 G/A» и

рецептора ангиотензина II типа 1 «1166 А/С» – HaeIII, PAI-1 «675 4G/5G» –

Bsc4I.

66

СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ

Полученные данные были проанализированы и обработаны с применением параметрических (при нормальном распределении признака в выборках, а также в случаях, когда объем выборки >100) и

непараметрических (при свободном распределении признака в выборках)

методов оценки достоверности различий сравниваемых выборок. Различия между сравниваемыми выборками принимались достоверными при уровне значимости (р) менее 0,05. Расчет производили при помощи программы

IBM® SPSS® Statistics Версия 19 .

67

ГЛАВА III. ТЕЧЕНИЕ БЕРЕМЕННОСТИ, РОДОВ И ПОСЛЕРОДОВОГО ПЕРИОДА У ЖЕНЩИН С АНЕМИЕЙ (ПО ДАННЫМ КАТАМНЕЗА).

Проведено ретроспективное изучение историй беременности и родов за 2005 – 2009 г.г. и из 423 историй беременности и родов отобрано 189

женщин с выявленной анемией различными гестационными осложнениями

на сроке от 28 до 41 недели беременности. Эти пациентки составили I

группу.

Основными критериями включения женщин в группу ретроспективного исследования явилось: снижение уровня Hb ≤110 г/л и RBC< 3,7 10 /л у

беременных; отсутствие в анамнезе заболеваний крови (гемоглобинопатии, лейкоз острый и хр., лимфогрануломатоз и др.).

Контрольную группу составили 150 беременных с физиологическим течением гестационного процесса.

Возраст беременных и родильниц колебался от 19 до 38 лет и составил в среднем 28,1±9,3 года

По данным 189 (отобранных из 423) историй беременности и родов женщин с анемией при настоящей беременности, закончившейся родами, у 24 (12,6%) анемия впервые был выявлена в I-ом триместре, у 112 (59,2%) - во II-ом, и у 53 (28%) – в III-ем триместре. Таким образом, чаще всего у беременных, выявляется во II-ом триместре, что согласуются с литературными данными.

В структуре экстрагенитальных заболеваний у обследованных пациенток преобладали инфекционно-воспалительные заболевания (острые респираторные вирусные инфекции – ОРВИ, тонзиллит, отит, бронхит и др.).

По сравнению с группой контроля у пациенток I группы достоверно чаще встречались заболевания ЛОР-органов- 63 (20,9%), более 2 эпизодов заболевания ОРВИ в год у 31 (10,2%) и заболевания ЖКТ- у 15 (4,9%)

женщин. Достоверно чаще регистрировались заболевания сердечно-

сосудистой системы: пролапс митрального клапана диагностирован у 19 (6,3%) пациенток. Также достоверно чаще по сравнению с группой контроля

68

зафиксировано варикозное расширение вен нижних конечностей- у 12 (3,9%)

женщин.

Особенности экстрагенитальной патологии у пациенток ретроспективной группы представлены в таблице № 12.

Таблица 12

Экстрагенитальные заболевания у пациенток ретроспективной группы

Звездочки – достоверность различия с данными контрольной группы: * - р-=0,001,

** р-=0,031

69