Volkova EM Kaspirovich DA Genetika s osnovami biometrii EUMK

Генетика с основами биометрии

ÏолесÃÓРисунок 2 – Открытие тран формации Ф. Гриффитсом

В ходе опыта было установл но, что по одновременного введения мышам убитых нагревани м до 65°С кл ток формы IIIS и живых клеток формы IIR животные погибают. При этом из их трупов выделяются клетки формы IIIS. В контро ьных эксп рим нтах мыши, зараженные только убитой формой IIIS или то ько живой формой IIR, не заболевали. Наглядно этот эксперимент представ ен на рисунке 3.

Рисунок 3 – Эксперимент Ф. Гриффитса

Генетика с основами биометрии

Ученый предположил, что убитые вирулентные пневмококки S-типа нагреванием располагают неким фактором, который устойчив и способен трансформировать невирулентные клетки R-типа в вирулентные. В результате они становятся слизистыми и покрываются полисахаридной капсулой. Было выдвинуто предположение, что трансформирующий фактор – это белок. Общая схема эксперимента приведена на рисунке 4.

ÏолесÃÓРисунок 4 – Эксперимент Ф. Гриффитса

Поворотом в генетике было открытие в 1944 г. трансформирующей функции ДНК. Группа американских бактериологов – О. Эвери, Ч. Мак-Леод и М. Мак-Карти – проводила и дования вирулентности возбудителя пневмонии бактерии Diplococcus pneumoniae. Их эксперимент доказал, что веществом, вызывающим трансформацию бактерий, является ДНК. Это явилось первым мат риа ьным доказательством роли ДНК в наследственности – ку ьминаци й иссл дований, начатых Гриффитом в 1928 г.

Более наглядно р ь ДНК в передаче наследственной информации была установлена в 1952 г. американскими вирусологами А. Д. Херши и М. Чейзом при изучении разл жения фага Т2 (вируса бактерий). В опыте белки, входящие в пр теин вую б лочку вириона, были помечены радиоизотопной меткой S35 (сера), а ДНК – радиоактивным фосфором Р32. В дальнейшем вирус культивировался в клетках бактерий. После этого дочерние вирионы потомства фага подвергались радиометрическому анализу на распределение радиоактивных меток. Бвло установлено, что новое поколение фаговых частиц содержало только Р32, а это послужило основанием для заключения, согласно которому, именно ДНК, а не белок передается от родителей к потомству. О роли ДНК в передаче наследственной информации свидетельствует также открытие в 1952 г. Зайндером и Ледербергом явления трансдукции, заключающейся в переносе генетического материала фагами от одних бактерий к другим.

2. Репликация

Репликация ДНК – это образование идентичных копий ДНК для

Генетика с основами биометрии

передачи генетической информации в поколениях клеток и организмов. Репликация «стартует» с начала разъединения в определенной точке двойной спирали на цепи, каждая из которых после этого принимает матрицы для синтеза новой цепи. Участок, в котором в данный момент времени происходит синтез ДНК, называется вилкой репликации. В каждом сайте может формироваться одна или две репликационные вилки в зависимости от того, является ли репликация однонаправленной или двунаправленной. Обычно протекает второй вариант репликации. Через некоторое время после начала репликации можно наблюдать репликационный глазок. Это участок хромосомы, в котором ДНК уже реплицирована, и он окружен более

РепликацияÏолесÃÓучастка ДНК начинается только со строго определенного участка, называем го сайт м инициации. Понятно, что происходит это на первом этапе. В ген ме таких сайтов может быть, как один, так и множество. С сайтом инициации связан репликон – участок ДНК от одной точки «начала» репликации до следующей. Он содержит регуляторные элементы, необходимые для репликации. Геном бактерий, как правило, представлен одним репликоном, это значит, что репликация всего генома является следствием одного акта инициации репликации (рисунок 5).

протяж нными участками не реплицированной ДНК.

В репликационной вилке ДНК копирует крупный белковый комплекс (реплисома), ключевым ферментом которого является ДНК-полимераза. Репликационная вилка движется со скоростью порядка 100000 п.о. в минуту у прокариот и 500–5000 – у эукариот. Этот процесс обеспечивает точную

передачу генетической информации из поколения в поколение.

Репликация ДНК является ключевым обытием в ходе деления клетки. Принципиально, чтобы к моменту деления ДНК была реплицирована полностью и при этом только один раз. Это обе печивается определенными

механизмами регуляции р пликации ДНК. Этапы репликации:

Рисунок 5 – Особенности репликации у бактерий

Репликация у эукариотических организмов начинается на хромосоме во многих точках «origin» (рисунок 6). Геномы эукариот (а также их отдельные

Генетика с основами биометрии

хромосомы) состоят из большого числа самостоятельных репликонов, это значительно сокращает суммарное время репликации отдельной хромосомы.

Рисунок 6 – Особ нности р пликации у эукариотических организмов

Скорость репликации прокариотич ских и эукориотических организмов разная. Так в первом учае она составля т примерно 2000 нуклеотидов в секунду, а во втором – в 10 раз ниже – 100–200 нуклеотидов в секунду. Бактериальная хромосома реп ицируется за 40 минут, тогда как эукариотическая – б ее чем за 1 час. Особенности протекания репликции у про- и эукари т представ ены в таб ице 1.

Таблица 1 – Число, средняя длина репликонов и скорость репликации у различных рганизм в

Генетика с основами биометрии

Способы репликации ДНК, предлженные в начале изучения этого процесса: консервативный, полуконсервативный, дисперсный (рисунок 7).

При консервативном способе и ходная ДНК остается неизменной во время всего процесса репликации, и доч рние ДНК полностью состоят из вновь синтезированной ДНК.

При полуконсервативном способе в каждом акте репликации половина родительской ДНК переходит в дочернюю.

При дисперсн м спос бе ДНК распадается на короткие фрагменты, которые исп льзуются в качестве матриц для построения фрагментов двух новых молекул ДНК, единяющихся между собой.

3. П лук нсервативный способ репликации. Опыты Мезельсона и Сталя

ÏолесÃÓРисунок 7 – Спо обы репликации ДНК

В исходной молекуле ДНК две цепи расходятся вследствие разрыва водородных связей между азотистыми основаниями. Каждая из цепей – это матрица для образования новой цепи ДНК. Возникающие между азотистыми основаниями водородные связи соединяют две цепи: старую и новую. В результате каждая новая клетка получает гибридную молекулу ДНК, которая состоит из старой и новой цепи (рисунок 8).

Полуконсервативный способ репликации был доказан Дж. Тейлором в 1958 г. на митотических клетках корешков бобов. Семена бобов проращивались на среде, содержащей тимидин, в составе которого присутствовал радиоактивный водород ³Н. Радиоактивная метка включалась в ДНК и обнаруживалась в хромосомах делящихся клеток с помощью радиоаутографии.

Генетика с основами биометрии

ÏолесÃÓРисунок 8 – Схема полукон ервативной репликации ДНК

В нормальной среде после одного д л ния клеток метку обнаруживали в обеих хроматидах метафазных хромо ом, однако ее количество было меньшим наполовину, так как м тка оставалась только в материнской нити ДНК, а вновь синтезированная нить была уже без м тки. После второго деления одна хроматида сод ржа а м тку, а в другой она отсутствовала. Результаты опыта позво яют предпо ожить, что хроматида состоит из одной молекулы ДНК и ДНК реп ицируется полуконсервативно.

Доказательство п ук нсервативного характера было представлено М. Мезельсон м и Ф. Сталем в 1958 г. В эксперименте работа велась с ДНК меченными 15N и 14N. В перв м случае плотность ДНК составляет 1,724, а во втором – 14N г/см³. С целью их разделения ученые применили центрифугирование в градиенте плотности, устанавливаемом при высокой скорости в течение 50-60 часов водного раствора хлористого цезия 6М концентрации. В таком градиенте плотности хлористого цезия ДНК, когда она достигает седиментационного равновесия, образует полосу на уровне той плотности градиента, которая соответствует ее собственной (рисунок 9).

Рисунок 9 – Центрифугирование ДНК в градиенте плотности.

Генетика с основами биометрии

Бактерии Е. coli выращивали на протяжении 14 поколений на среде, содержащей радиоактивный азот (15N), для того, чтобы вся ДНК включила 15N и стала «тяжелой». Затем клетки синхронизировали и пересадили в среду с изотопом азота 14N, чтобы вновь синтезированные цепи ДНК стали «легкими».

Из клеток, выращиваемых на среде с легким (14N) начиная с первой генерации, выделяли ДНК и центрифугировали в градиенте плотности CsCI.

4. Ферменты репликации, схема репликационной вилки, особенности репликации ДНК у про- и эукариот

Рисунок 10 – Белок DnaA – инициатор репликации

ДНК-топоизомеразы – изменяют степень сверхспирализации ДНК путем внесения одноцепочечных или двухцепочечных разрывов в ДНК;

ДНК-хеликаза – разделяет двухцепочечную ДНК на одинарные цепи;

Генетика с основами биометрии

ДНК-полимеразы – катализируют синтез дочерних цепей на матрице ДНК по принципу комплементарности;

ДНК-лигаза – сшивает одноцепочечные фрагменты ДНК.

Хеликазы – это ферменты, которые способны расплетать две комплементарные нити ДНК с использованием энергии, полученной при гидролизе АТФ.

У бактерий имеется две хеликазы – хеликаза Rep и хеликаза DnaB. Хеликаза Rep продвигается от 3’-конца к 5’-концу цепи ДНК, служащей

матрицей для ведущей цепи ДНК.

Хеликаза DnaB продвигается по противоположной цепи, служащей для синтезаÏолесÃÓзапаздывающей цепи.

Роль ssb-белков заключается в том, что они связываются с однонитчатой ДНК, выпрямляют ее и блокируют образование шпилечных двухнитчатых структур (рисунок 11).

SSB-белки обнаружены в 1968 г. Они снижают температуру плавления ДНК in vitro на 20-40◦С и связываются с ДНК электростатически.

Рисунок 11 – Структура ssb-белков

У ssb-белк в п вышенн сродство к одноцепочечной ДНК, с которой они связываются, не закрывая азотистые основания. Они крепятся по всей длине разделившихся цепей и предотвращают их комплементарное скручивание, образование «шпилек». Белки не связываются с двуцепочечной ДНК, не имеющей расплавленных участков.

Репликационная вилка – Y-образная структура, перемещающаяся вдоль родительской спирали ДНК и характеризующаяся расхождением двух ее цепей, в пределах которой происходит активная репликация ДНК (рисунок

12).

Генетика с основами биометрии

Рисунок 12 – Схема репликационной вилки

Репликация молекул ДНК у прокариот протекает несколько иначе, чем у эукариот. У прокариот одна из нитей ДНК разрывается, и один конец ее прикрепляется к клеточной мембране, а на противоположном конце происходит синтез дочерних нит й. Такой интез дочерних нитей ДНК получил название «катящ гося обруча». У бактерий скорость репликации составляет 30 мкм в минуту. За минуту к нитке-матрице присоединяется около 500 нуклеотидов, у вирусов – порядка 900. У эукариот процесс репликации несколько медленнее. У них доч рняя нить удлиняется на 1,5-2,5 мкм в минуту.

ДНК всех живых существ устроена одинаково, но различается коэффициент м вид специфичности, который представляет собой отношение молекулярн й суммы А+Т к молекулярной сумме Г+Ц. Видоспецифичность

Генетика с основами биометрии

ÏолесÃÓРисунок 14 – Репликация хлоропластных и митоходриальных геномов