Volkova EM Kaspirovich DA Genetika s osnovami biometrii EUMK

Генетика с основами биометрии

бактериальной хромосомой, но плазмидами. Плазмиды – это внехромосомные факторы наследственности, представляющие собой небольшие кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, которые располагаются в цитоплазме и способны к автономной репликации. В плазмидах закодирована информация необходимая для репликации плазмид в бактериях, а также информация о дополнительных признаках, сообщающих бактериям преимущества в тех или иных условиях обитания и в стрессовых ситуациях. В одной клетке может быть несколько плазмид, совокупность которых называют плазмотипом. Например, Borrelia burgdorferi B31 содержит 17 плазмид общим размером

называют эписомами. Репликация плазмид начинается со связывания с итероном (место старта репликации) инициирующего репликацию белка.

сравнимым с геномным – 0,53×106 п.о. (против 0,91×106 п.о. в геноме). ПлазмидыÏолесÃÓмогут интегрировать в бактериальную хромосому, тогда их

Плазмиды классифицируют на несколько групп в зависимости от: 1. Размера: большие, средние, малые (космиды).

2. Способности вызывать конъюгацию бактерий: конъюгативные, которые

имеют относительно большие размеры и одержат информацию, необходимую для автономной репликации и перено а ДНК реципиенту; неконъюгативные, которые не способны запускать конъюгацию, но способные передаваться реципиенту при наличии в кл тке конъюгативных плазмид.

3. Способности к р пликации в одной клетке: совместимые и

несовместимые.

4. Кодируемого фенотипич ского эфф кта: фертильности – F плазмиды; бактериоциногении – Сol-п азмиды (ColE1, ColE2); резистентности – R- плазмиды, буслав ивающие устойчивость или множественную устойчивость

к антибиотикам, с ям тяже ых мета лов, УФ излучению; вирулентности –

пплазмиды LT2, K88, к дируют продукцию энтеротоксинов, фимбрий; биодеградации – D-плазмиды, обеспечивающие расщепление сложных субстратов (углев д р д в нефти и т.д.); криптические (фенотипический эффект не установлен).

R-плазмиды остоят из двух участков:

1. Фактора переноса устойчивости, или RTF, содержащего гены

репликации и переноса в клетку реципиента.

2. R-детерминанты, содержащей гены или транспозоны резистентности. Плазмиды участвуют в генетических перестройках, обеспечивают

горизонтальный перенос генов, используют в качестве векторов в генной инженерии.

Организация генетического аппарата у вирусов. Генетический аппарат вирусов несет информацию о нескольких типах белков, которые необходимы для образования нового вируса: ген, кодирующий обратную транскриптазу и другие.

Генетический материал вируса может быть представлен либо ДНК, либо

Генетика с основами биометрии

РНК, соответственно, вирусы подразделяют на ДНК-содержащие и РНКсодержащие. Подавляющее большинство вирусов являются РНКсодержащими. Вирусы растений чаще всего содержат одноцепочечную РНК, а бактериофаги, как правило, обладают двухцепочечными ДНК.

Вирусный геном может быть кольцевым, как у полиомавирусов, или линейным, как у аденовирусов. Форма генома не зависит от типа нуклеиновой кислоты. У многих РНК-содержащих вирусов и некоторых ДНК-содержащих вирусов геном часто представлен несколькими молекулами (частями), в связи с чем он называется сегментированным. У РНК-содержащих вирусов каждый

сегмент часто кодирует только один белок, и обычно эти сегменты упаковываютсяÏолесÃÓв один капсид.

Вирусные геномы независимо от типа нуклеиновый кислоты практически всегда бывают либо одноцепочечным, либо двухцепочечным. Второй включает пару комплементарных цепей нуклеиновой кислоты, а первый – только одну цепь. Геном вирусов некоторых семейств (например, Hepadnaviridae) частично одноцепочечный и частично двуцепочечный.

Для большинства РНК-содержащих виру ов и некоторых вирусов с одноцепочечной ДНК определяют полярно ть нуклеиновой кислоты в зависимости от того, комплементарна ли она виру ной мРНК. Молекула РНК с положительной полярностью (плюс-ц пь) имеет ту же последовательность нуклеотидов, что и мРНК, поэтому, по крайн й мере, какая-то ее часть может незамедлительно начать транслироваться клеткой-хозяином. РНК с отрицательной по ярностью (минус-ц пь) комплементарна мРНК, поэтому до начала трансляции на ней до жна быть синтезирована положительная РНК при помощи фермента РНК-зависимой-РНК-полимеразы. Названия цепей ДНК для вирус в, с держащих одноцепочечную ДНК, сходны с таковыми для РНК: кодирующая цепь к мп ементарна мРНК (-), а некодирующая является ее копией (+). Однако ген мы нескольких типов ДНК- и РНК-содержащих вирусов представлены м лекулами, имеющими различную полярность, то есть транскрипции может подвергаться любая цепь. Таковы, например, геминивирусы – вирусы растений, содержащие одноцепочечную ДНК, – иаренавирусы – вирусы животных одноцепочечной РНК.

Размер генома широко варьирует у различных видов. Самым маленьким одноцепочечным ДНК-геномом обладает цирковирус из семейства Circoviridae: его геном кодирует лишь два белка и содержит всего 2000 нуклеотидов. Один из самых крупных геномов обнаружен у мимивируса: он содержит свыше 1,2 млн п.о. и кодирует более тысячи белков. Как правило, РНК-содержащие вирусы имеют меньший геном, чем ДНК-содержащие – размер их генома ограничен из-за большей вероятности ошибок во время репликации. При большем размере генома ошибки, произошедшие во время его репликации, сделали бы вирус нежизнеспособным или неконкурентоспособным. Чтобы преодолеть это ограничение, РНК-вирусы

Генетика с основами биометрии

часто имеют сегментированный геном – это уменьшает вероятность того, что ошибка в одном из сегментов окажется фатальной для всего генома. Напротив, ДНК-содержащие вирусы обычно имеют более крупные геномы благодаря большей точности их репликативных ферментов. Однако вирусы, содержащие одноцепочечные ДНК, являются исключением из этого правила – скорость накопления мутаций в их геномах приближается к таковой для вирусов, содержащих одноцепочечные РНК.

3. Трансформация

Трансформация бактерий – это перенос ДНК, изолированной из одних клеток, ÏолесÃÓв другие.

При трансформации ДНК, выделенную из клеток одного штамма, поглощают клетки другого штамма – реципиента.

Трансформация возможна у целого ряда бактерий: Diplococcus, Hemophilus, Neisseria, Bacillus, а также у актиномицетов, цианобактерий и других, и она имеет общие закономерности. Лучше всего трансформация изучена у таких бактерий, как D. pneumoniae, В. subtilis, Н. influenzae.

Для того чтобы ДНК проникла в бактериальные клетки, они должны находиться в состоянии компетентно ти. Сначала ДНК связывается с поверхностью компетентных кл ток. Обычно тран формирующая ДНК имеет молекулярную массу около 1×107 Д, что о тавляет около 0,5% бактериальной хромосомы. ДНК, связанная с комп т нтными клетками, расщепляется специальными нук еазами до фрагм нтов с молекулярной массой 4-5×106 Д. После этого фрагменты ДНК проникают в клетку. Некоторые бактерии, в частности пневм к кки, м гут неспецифически поглощать ДНК из разных источников. В то же время, например, Hemophilus, поглощает только свою, гомологическую ДНК.

Фрагменты менее 5-105 Д в клетку не проникают.

После п падания в бактерию двуцепочечная ДНК превращается в одноцепочечную: одна нить ДНК деградирует. На заключительной стадии происходит интеграция одноцепочечного трансформирующего фрагмента с ДНК клетки-реципиента. При этом репликация не требуется, и включаемый фрагмент физически объединяется ДНК реципиента. Весь процесс трансформации завершается в течение 10-30 мин. Частота трансформации разных бактерий составляет около 1%.

Для некоторых бактерий показана трансформация в естественных условиях, например, в организме инфицированного животного – для

Diplococcus pneumoniae, а также в условиях культуры – для Bacillus sublilis.

Это означает, что трансформация – не экзотический прием генетического анализа, а естественный биологический процесс.

В то же время в последние годы в связи с развитием генной инженерии широко применяется плазмидная трансформация, которая заключается во

Генетика с основами биометрии

введении в клетки бактерий, а также эукариот генов, интегрированных в естественные или искусственные плазмиды.

4. Трансдукция. Использование бактериофагов для картирования хромосомы бактерий

Трансдукцией называют перенос генов из одних бактериальных клеток в другие при помощи бактериофага. Это явление в 1951 г. открыл Н. Зиндер. Перед рассмотрением трансдукции важно изучить взаимоотношения между бактериями и бактериофагами.

Вирулентные и умеренные бактериофаги. Бактериофаги, или вирусы бактерий, делят на две категории: вирулентные и умеренные. Вирулентный бактериофаг, проникая в клетку, вызывает литическую реакцию, т.е. размножается и лизирует бактерию. Умеренные бактериофаги могут вызывать как литическую, так и лизогенную реакцию. В последнем случае инфицирующий фаг переходит в состояние профага, который воспроизводится синхронно с хромосомой бактерии. Бактерии, несущие профаг, называют лизогенными. Лизогенные бактерии приобретают иммунитет, т.е. устойчивость к дополнительному заражению тем же

и стимулируетсяÏолесÃÓце ым рядом аг нтов, повреждающих ДНК: ультрафиолет выми и рентгеновскими лучами, алкилирующими

бактериофагом, который их лизогенизировал.

Лизогенное состояние устойчиво во производится. Профаг при этом теряется частотой около 1 на 105-106 кл точных делений. В лизогенных культурах может происходить индукция бактериофага, в результате чего наблюдается массовый изис бакт рий. Такое явление происходит спонтанно

соединениями, рганическими перекисями и т.д. Виды трансдукции:

1. Общая трансдукция. Трансдукцию осуществляют умеренные бактериофаги. К их числу тн сится фаг Р22, при помощи которого Н. Зиндер впервые обнаружил трансдукцию у Salmonella typhimurium.

Два штамма этой бактерии, нуждавшиеся в аминокислотах (один – phe trp tyr ++, другой – + + met his), высевали в смешанной культуре на минимальную среду. В результате появились прототрофные колонии с частотой около 1×10-4. Как видно, логика эксперимента была та же, что и при поисках конъюгации у Е. coli. Иными оказались результаты выращивания двух названных штаммов S. typhimurium в разных отростках U-образной трубки, разделенных бактериальным фильтром. Рекомбинанты были получены и в этом случае. Следовательно, для их образования не нужен

контакт между клетками, как при конъюгации.

Перенос генов при общей трансдукции может привести к двум различным состояниям трансдуктантов. В одних случаях привнесенный ген наследуется стабильно, поскольку интегрирует с хромосомой реципиента. Это

Генетика с основами биометрии

полная трансдукция. В других случаях при абортивной трансдукции

внесенный фагом фрагмент генома не реплицируется и передается по одной линии при размножении трансдуктанта, т.е. из двух клеток – потомков каждого деления – лишь одна получает трансдуцированный ген. Так можно трансдуцировать ген, определяющий наличие жгутика у S. typhimurium. В этом случае во всем клоне – потомстве трансдуктанта – жгутик, а, следовательно, подвижность сохраняет только одна клетка. Абортивная трансдукция происходит чаще, чем полная, иногда в 10 раз.

2. Специфическая трансдукция отличается от неспецифической тем, что

бактериофаг может переносить только определенные гены, как это характерно для фагаÏолесÃÓк Е. coli, который может трансдуцировать только гены локуса gal, ответственного за усвоение галактозы, и bio – гены синтеза биотина.

Умеренный бактериофаг при лизогенизации Е. coli интегрирует в ее хромосому на участке между локусами gal и bio. Это было показано в конъюгационных скрещиваниях лизогенных Hfr и нелизогенных F--бактерий. Gal+-трансдуктанты возникают обычно с частотой 1×10-5-10-6 и, как правило, генетически нестабильны. Они выщепляют клетки Gal-1 частотой около 2×10-3 на клеточное деление. Это явление объя няет я тем, что трансдуктанты Gal+ частично гетерозиготны gal/gal+ т.е. не ут дополнительный фрагмент gal+ вместе с участком gal р ципи нта. Такое состояние называется

гетерогенотой.

При облучении гетерог нот УФ-лучами удалось получить фаголизаты, способные к трансдукции с оч нь высокой частотой.

Почти половина вс х частиц λ могла передавать признак Gal+ при трансдукции. Изучение фаг в из таких лизатов, названных HFT (от англ. high frequency transduction), п каза о, что гены gal переносят так называемые дефектные фаги λ, т. . такие, которые, лизогенизируя бактерии, сообщают им устойчивость к суперинфекции λ, но в дальнейшем лизогенные бактерии не способны пр дуцир вать инфекционные частицы бактериофага. Дефектные трансдуцирующие частицы λ, обозначаемые к gal, не образуют стерильных пятен на газоне Е. coli. Они не могут самостоятельно размножаться. Для этого им требуется фаг – помощник: нормальный, не способный к трансдукции.

5. Конъюгация бактерий

Конъюгацией называется непосредственный контакт между клетками бактерий, сопровождаемый переносом генетического материала из клеток донора в клетки реципиента.

Процесс конъюгации у бактерий E. coli был открыт в 1946 г. Дж. Ледербергом и Е. Тэйтумом. В ходе исследований ученые руководствовались следующими принципами, ставшими затем классическими при обнаружении полового процесса у любых микроорганизмов:

необходимо работать со штаммами одного вида бактерий;

Генетика с основами биометрии

следует учитывать различия по нескольким стабильным

признакам;

для получения гибридов или рекомбинантов необходимо применять метод селективных сред, позволяющих регистрировать даже очень редкие события.

В отношении первых двух положений эта методология восходит к правилам менделевского гибридологического анализа.

В соответствии с изложенными принципами Дж. Ледерберг и Е. Тэйтум взяли два штамма Е. coli, маркированные несколькими мутациями

Первый штамм нуждался в треонине, лейцине и тиамине, а второй – в биотине и метионине. Реверсию, т.е. восстановление прототрофности по отдельным признакам, наблюдали с частотой около 1х10-7. Следовательно, выбранные штаммы могли бы ревертировать к дикому типу, т.е. к полной прототрофности с частотой 1-10-14-1 × 10-21, е ли реверсии по всем признакам происходят независимо друг от друга.

Эти штаммы смешали в жидкой полноценной среде и инкубировали в течение 24 ч. После этого см ь вы яли на минимальную среду, не

представляет б й как й-то вариант полового процесса.

Перен с ген в при к нъюгации. Маркеры донора передаются реципиенту в определенн й п след вательности с убывающей вероятностью. Это указывает на риентир ванный перенос генетического материала.

Ф. Жакоб и Е. Вольман в 1961 г. провели эксперименты по прерыванию конъюгации у Е. coli. Они смешивали клетки F- и Hfr при 37°С в жидкой среде. Через равные интервалы времени они отбирали пробы и встряхивали их в гомогенизаторе при 4°С, тем самым прерывая конъюгацию. Затем высевали на среду для учета рекомбинантов по различным маркерам. Первые 8 мин. рекомбинантов вообще не было, а затем они стали появляться в характерные для каждого типа рекомбинантов временные интервалы. С тех пор этот метод получил широкое распространение. Расстояния на генетической карте Е. coli измеряются в минутах.

Репликация при конъюгации. Взаимоотношения F-эписомы и бактериальной хромосомы можно представить следующим образом. В клетках F отсутствует F-фактор. Клетки F+, в результате потери F-фактора становятся клетками F-. Перенос F-фактора в клетки F- превращает их в клетки F+.

Генетика с основами биометрии

Возможна интеграция F-фактора с бактериальной хромосомой, и тогда при конъюгации она переносится в F-реципиенты. У штаммов Hfr F-фактор интегрирован с хромосомой, F-фактор – представитель более широкого класса конъюгативных плазмид, обнаруженных у разных бактерий, способных мобилизовать хромосому при конъюгации и передавать ее реципиентам.

Стрелки на внутреннем кольце (рисунок 3) – точки интеграции F- фактора и направление переноса хромосомы

Присутствие F-факт ра определяет образование на клетках Е. coli половых ворсинок, или пилей, выполняющих активные функции при конъюгации. Они есть у F+ и у Hfr, но не у клеток F-. Именно на этих половых ворсинках адсорбируются бактериофаги, специфичные к мужским клеткам, или мужские бактериофаги. Это РНК-содержащие фаги: R17, MS2, Qβ, f2, а также фаги одноцепочечной ДНК: fd, fl, М13. Половые пили, по-видимому, необходимы для удержания конъюгирующих бактерий.

ÏолесÃÓРисун к 3 – Генетическая карта Е. coli

Обычно автономный F-фактор при размножении бактерий реплицируется, подобно бактериальной хромосоме, образуя θ-образные фигуры в качестве промежуточного продукта репликации. Установление конъюгационного контакта между клетками, возможно, служит сигналом для активации или синтеза ферментов, участвующих в переносе ДНК, в частности ферментов, разрывающих одну нить в ДНК F-фактора.

Однонитевой разрыв отмечается в точке, отличной от обычной точки

Генетика с основами биометрии

инициации репликации F-фактора. Если скрещиваются F+ и F, то освобождаемый в результате надреза в конец цепи ДНК начинает «разматываться» и проникает в клетку F-. Таким образом, в донор попадает одноцепочечная копия F-фактора, которая там реплицируется и превращается в двуцепочечную форму, замыкающуюся в кольцо. То, что в F--клетки передается только одна цепь F-фактора, показано с помощью так называемых мини-клеток Е. coli.

У этой бактерии есть F-штаммы, в значительном количестве образующие абортивные клетки размером около 10% от нормальных и лишенные нуклеоида. Это и есть мини-клетки. Они не способны реплицировать ДНК. После конъюгации с клетками F+ из мини-клеток были

– с самымиÏолесÃÓпоследними, что бывает очень редко из-за разрывов конъюгационного канала и перено имой ДНК.

выделены одноцепочечные копии F-ДНК.

Если F-фактор интегрирован с хромосомой, то при конъюгации надрез F-фактора инициирует ее репликацию по механизму катящегося кольца и передачу однонитевой копии хромосомы в клетку-реципиент. Это также было

Генетика с основами биометрии

4.МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

4.1ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РОЛЬ ДНК И РНК

ПЛАН

1. Генетическая роль ДНК и РНК, ее доказательство. 2. Репликация.

3. Полуконсервативный способ репликации. Опыты Мезельсона и Сталя.

4. Ферменты репликации, схема репликационной вилки, особенности репликацииÏолесÃÓДНК у про- и эукариот.

1. Генетическая роль ДНК и РНК, ее доказательство

ДНК – это полимерная молекула, включающая пару пуриновых – аденин

(А), гуанин (G) и пару пиримидиновых оснований – тимин (Т), цитозин (С).

Каждое из них соединен с одной молекулой ахара – дезоксирибозой и с остатком фосфорной кислоты в виде дезоксирибонуклеотидов, представляющих собой мономеры, входящие в о тав ДНК и образующие полидезоксирибонуклеотиды, или полинукл отиды.

Американский биохимик Э. Чаргафф в 1949-1951 гг. установил

следующую закономерность: колич ство А в любой молекуле ДНК равно количеству T, а ко ичество G равно колич ству С. Это явление было названо

правилом Чаргаффа.

Опираясь на прави Чаргаффа, Дж. Уотсон и Ф. Крик построили в 1953 г. трехмерную м де ь ДНК из обычных кусков картона, пространственная

организация к т р й и другие ее особенности остается актуальной до сих пор. В структуре ДНК зал жена возможность так называемой конвариантной редупликации. Этим термин м Н.В. Тимофеев-Ресовский назвал способность живых организмов воспроизводить себе подобных, мутировать и вновь воспроизводить мутантные варианты. Иначе говоря, свойства наследственности и изменчивости оказались связанными со свойствами конкретного химического соединения – универсального носителя

наследственной информации.

Долгое время считалось, что ДНК может быть только в виде правозакрученной спирали. Однако в 1979 г. американский ученый А. Рич доказал, что ДНК существует и в виде левозакрученной спирали (рисунок 1).

Эта форма – Z-ДНК встречается на участках, обогащенных парами G–С и, играет существенную роль в процессах рекомбинации и регуляции действия генов.

Генетика с основами биометрии

Дальнейший прогресс в понимании м ханизмов репликации генов, их функционирования и п р комбинации в ецело связан с успехами

молекулярной генетики. Родилась новая отрасль науки – генная инженерия, которая позволяет манипу ировать индивидуальными генами, получать в пробирке их новые соч тания, получать мутации по желанию экспериментатора, переносить гены одних организмов в клетки других и таким образ м к нструир вать био огические системы, которых никогда не было в прир де.

Доказательство генетической роли ДНК. Первое прямое доказательство генетическ й р ли ДНК принадлежит Ф. Гриффитсу, открывшему трансформацию пневм к кк в в 1928 г.

ÏолесÃÓРисунок 1 – про тран твенная организация ДНК

У пневмококков два типа штаммов, различающихся по характеру роста на плотных средах и одновременно по свойству патогенности по отношению к подопытным животным – мышам. S-форма микроорганизма образует на агаре гладкие блестящие колонии благодаря тому, что клетки заключены в полисахаридную капсулу. S-форма является патогенной для мышей, так как полисахаридная капсула предохраняет бактериальные клетки от иммунной системы зараженного животного. Мыши, которым вводили живые клетки S- формы пневмококка, погибали. По антигенным свойствам капсулы различают несколько типов S-форм: IS, IIS, IIIS и т.д. (рисунок 2).