Volkova EM Kaspirovich DA Genetika s osnovami biometrii EUMK

Генетика с основами биометрии

Современные подходы к борьбе с наследственными болезнями:

1. Генодиагностика – включает методы, позволяющие выявлять изменения в структуре генома. Для ДНК-диагностики характерны: высокая специфичность и чувствительность; достоверность и простота. Способы ДНКдиагностики: определение специфических нуклеотидных последовательностей посредством гибридизации нуклеиновых кислот, определение специфических нуклеотидных последовательностей при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). И в том, и в другом случае используются зонды, позволяющие выявлять комплементарные последовательности (искомого участка ДНК). В

наши дни известно как минимум о 100 ДНК-зондах. 2.ÏолесÃÓГенетическая терапия – это единственный способ излечения

наследственных и других заболеваний. Все остальные только смягчают или временно устраняют симптомы. Разновидности генотерапии: заместительная; корректирующая. В первом случае в клетку вводится неповрежденный ген с последующим созданием условий для его экспрессии. К заместительной генотерапии прибегают, когда болезнь является следствием отсутствия или малого количества белкового продукта. Вно имая копия принимает на себя функции сохранившегося в геноме дефективного гена. Корректирующая генотерапия предполагает замену проблемного гена нормальным. Эта стратегия борьбы с заболеваниями пока не нашла практического применения. Принципы лечения: генетич ская т рапия ex vivo; генетическая терапия in

Экология. Хозяйственная д ят ьность человека – это основная причина

сокращения площади сов, изм н ния водного баланса, наличия

загрязняющих примесей в в д емах, воздухе и почве.

Для пр гн зир вания и предотвращения нежелательных последствий

вмешательства в прир ду че века необходимы знания не только экологии, но

популяционн й генетики, так как она имеет дело с большими численностями организмов, расп лагает сп бами определения оптимального соотношения различных видов. Одна из приоритетных целей генетики популяций – сохранение генофонда имеющихся видов.

Генетики-экологи большое значение придают изучению мутагенной активности физических и химических агентов, которые использует человек. Ежегодно различным отраслям предлагаются новые вещества. Все они испытываются на генетическую активность. В этом деле помогают специальные тест-системы, созданные на основе штаммов микроорганизмов, культур дрозофилы, линий мышей, культур клеток животных, человека.

1.4. Методы генетики

Гибридологический метод. Этот метод очень схож с методом генетического анализа, но не исчерпывает его, так как в генетическом анализе гибридологический метод часто сочетается с методами получения мутаций.

Генетика с основами биометрии

Условия проведения гибридологического анализа:

1.Принадлежность скрещиваемых организмов к одному виду.

2.Четкое различие скрещиваемых организмов по отдельным признакам.

3.Константность изучаемых признаков – их воспроизведение из поколения в поколение при скрещивании в пределах линии.

4.Характеристика и количественный учет всех классов расщепления, если оно наблюдается у гибридов первого и последующих поколений.

Математический метод. Генетика как наука не состоялось бы без математического метода. Количественный анализ позволил Г. Менделю

изучить результаты скрещиваний, построить гипотезы, объясняющие полученныеÏолесÃÓрезультаты. Сравнение количественных данных эксперимента с теоретически ожидаемыми величинами – это неотъемлемая часть генетического анализа. В процессе такого сравнения используются методы вариационной статистики. Математический метод незаменим при изучении наследования количественных признаков, а также при изучении изменчивости, особенно ненаследственной, или модификационной.

Цитологический метод. И пользует я для изучения клетки как основной единицы живой материи. И ледование троения хромосом вместе с гибридологическим анализом – это о нова цитогенетики.

В свое время результаты изуч ния параллелизма в поведении хромосом

инаследовании признаков позволило заложить основу формирования хромосомной теории насл дств нности. В настоящее время анализ конъюгации хромосом в м йозе, наб юд ние обменов между гомологичными

инегомологичными хромосомами расширяют представления о материальных носителях наследственн сти.

Мон с мный мет д. Дает возможность установить хромосому с искомым ген м, а в с четании с рекомбинационным методом – место локализации гена в хр м с ме этого гена.

Гене л гический мет д. Это вариант гибридологического метода, согласно которому наследование признаков изучается посредством анализа родословных и с учетом проявления этих признаков у животных родственных групп в нескольких поколениях. Генеологический метод широко применяется при изучении наследственности у человека и животных, малоплодие которых имеет видовую обусловленность.

Близнецовый метод. Применим при изучении влияния определенных факторов внешней среды и их взаимодействие генотипом животных, а также

при установлении относительной роли генотипической и модификационной изменчивости в общей изменчивости признака. Близнецы – потомки, родившиеся в одном помете одноплодных животных. Они бывают идентичными (однояйцевыми), с одинаковым генотипом и неидентичными (разнояйцевыми), возникшими из раздельно оплодотворенных двух и более яйцеклеток.

Генетика с основами биометрии

Мутационный метод. Цель – определение характера влияния мутагенных факторов на генетический аппарат клетки, ДНК, хромосомы. Мутагенез – один из инструментов изменения организма с целью повышения его продуктивности, устойчивости к заболеваниям.

Популяционно-статистический метод. Применяется для изучения явлений наследственности в популяциях. С его помощью устанавливают частоту доминантных и рецессивных аллелей, ассоциированных с тем или иным признаком, частоту доминантных и рецессивных гомозигот, гетерозигот, динамику генетической структуры популяций под влиянием мутаций, изоляции, отбора и прочих факторов.

ФеногенетическийÏолесÃÓметод. Позволяет установить степень влияния генов и условий среды на свойства и признаки организмов в онтогенезе.

Моделирование помощью ЭВМ. Это эффективный способ изучения особенностей наследования количественных признаков в популяциях, оценки селекционных методов, например, массового отбора, отбора животных по селекционным признакам. Особый интерес данный способ представляет для генетической инженерии, молекулярной генетики.

Генетика с основами биометрии

2. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ХРОМОСОМ

ПЛАН

1.Строение хромосом.

2.Упаковка ДНК в разных ядерных структурах, в том числе в хромосомах.

3.Кариотип и идиограмма.

1. Строение хромосом

посерединеÏолесÃÓили некоторым отк он ни м от нее.

Морфология хромосом обычно описывается на стадии метафазы или

анафазы, когда они лучше всего видны в клетке. Есть растения, морфологию хромосом которых можно описать в профазе мейоза или митоза.

Один из критериев классификации хромосом – расположение

центромеры (рисунок 1). Различают:

акроцентрические (палочкообразные). Хромосомы, центромера

которых находится на конце или второе плечо настолько мало, что оно неразличимо на цитологических препаратах;

Рисунок 1 – Типы метафазных хромосом в зависимости от положения центромеры

Объективный критерий, позволяющий отнести хромосому к той или иной группе, – центромерный признак, – отношение длины короткого плеча к длине хромосомы в процентах:

акроцентрические – до 12,5%;

субметацентрические – 12,6-37%;

метоцентрические – 37,1-50%.

Генетика с основами биометрии

Центромеру также называют первичной перетяжкой. Она определяет движение хромосомы и различима в виде более светлой зоны, которая движется в митозе и увлекает за собой несколько отстающие плечи хромосомы. Центромера имеет сложное строение: в ней находится ДНК с характерной последовательностью нуклеотидов, ассоциированная со специальными белками.

На хромосоме, как правило, имеется одна центромера, потеря которой может привести к нарушению подвижности и потере хромосомы, – следствие хромосомной аберрации, вызванной ионизирующим излучением.

Есть виды, содержащие полицентрические хромосомы с так называемой

нити хроматинаÏолесÃÓ. Форма и величина спутника постоянны для хромосом.

диффузной центромерой:

растение рода Lusula (ожика);

животные Ascaris megalocephala;

насекомые отряда Hemiptera и другие.

На хромосомах имеются и вторичные перетяжки, которые не являются

местом прикрепления нитей веретена деления, и они не определяют угла изгиба хромосом при их движении. Вторичные перетяжки также называются ядрышковыми организаторами. В них локализуют я гены, отвечающие за

синтез рРНК.

Теломеры в значит льной т п ни ответ твенны за существование

хромосом как индивидуальных образований и препятствуют их слипанию. Структура хромосом, видимых в св товой микроскоп, представлена:

темными участками и и г т рохроматином;светлыми участками и и эухроматином.

В гетер хр матине в сравнении с эухроматином спирализация хромосом

очевиднее. При эт м активность гетерохроматиновых участков меньше таковой эухр матин вых участков. Особенности распределения эу- и

Дифференциальная окраска хромосом. Один из способов выявления дифференцировки хромосомы по длине – окраска красителями, имеющими сродство к участкам ДНК определенного строения.

Даже окраска по Фельгену, которая специфична относительно дезоксирибозы ДНК, при использовании некоторых предобработок позволяет выявлять участки хромосом, окрашивающиеся с разной интенсивностью.

При Q- и Н-окраске используются флуоресцирующие красители – квинакрин (quinacrine) и Hoechst 33258, соответственно. Они позволяют выявлять участки хромосом, обогащенные парами нуклеотидов А-Т.

Генетика с основами биометрии

человека в этих участках часто локализуются повторяющиеся последовательности LINE.

R-окраска основана на использовании специальной предварительной обработке с последующей окраской красителем Гимза. Применяется для выявления поперечной исчерченности хромосом, обратной той, которая выявляется G-окраской. Участки R обогащены генами, которые содержат повышенное число пар Г–Ц, в них (у человека) часто встречаются повторяющиеся элементы SINE.

Т-окраска – вариант R-окраски, предназначенный для выявления

преимущественно концевых (теломерных) участков, наиболее обогащенных генами, парами Г–Ц и элементами SINE.

гетерогеннÏолесÃÓсти хр м м по д ине.

С-окраска, основана на тепловой денатурации и последующей ренатурации ДНК и окраской по Гимза. Это инструмент выявления

преимущественно гетерохроматиновых участков хромосом.

FISH (fluorescent in situ hybridization) – дает возможность выявлять

участки гомологии какому-либо фрагменту предварительно

денатурированных молекул ДНК, объединенному с флуоресцирующим

красителем, используемому в каче тве зонда при гибридизации,

непосредственно на цитологических препаратах.

GISH (genomic in situ hybridization) – аналог метода FISH, но использующий в качестве зонда полную г номную ДНК какого-либо вида.

Позволяет выявлять участки гомологии на пр паратах хромосом другого вида.

Два последних метода не относятся к методам дифференциальной окраски в строгом смыс е с ова, но они также делают возможным выявление

Дополнительные в зможности для выявления структурнофункциональн й дифференциации хромосом по длине открывают методы иммунодетекции белк в, взаимодействующих с ДНК хромосом постоянно или только на пределенных стадиях клеточного цикла. Флуоресцентная микроскопия, компьютерные обработки изображений позволяют создавать многоцветные, эффектные образы хромосом.

Хромомерная организация хромосом. Хромосомная нить на стадии профазы митоза содержит небольшие сильно окрашивающиеся тельца,

называемые хромомерами.

Наиболее выраженными являются хромомеры, встречающиеся в политенных хромосомах и хромосомах типа «ламповых щеток».

Виды известных хромомер:

лептотенные;

пахитенные;

хромосом типа «ламповых щеток»;

интерфазных политенных хромосом. Общие свойства хромомер:

Генетика с основами биометрии

1.Представляют собой отрезки компактизованной ДНК.

2.Число и рисунок хромомер у данного организма постоянны на данной стадии клеточного цикла.

Число хромомеров существенно варьирует в разных типах тканей. Пример: пахитенные хромосомы Ornithogalum virens содержат 274 хромомеров, а в профазе митоза в клетках пыльцы их насчитывается 67. Причина такого различия связана с тем, что хромосомы клеток, находящихся на разных стадиях клеточного цикла, имеют разную степень компактизации.

Изменение числа хромомеров сопровождается изменением их

генетического содержания.

величинаÏолесÃÓставляет 7,5 мкм.

Результаты исследований Дж. Беллинга, Лима-де-Фариа, X. Кэллана, Х. Бауера и других ученых позволяют сделать вывод, что хромомеры – это фрагменты хромосом, способные к локальной компактизации. Длина фрагмента ДНК, входящего в состав хромомера, различна на разных этапах процесса компактизации хромосом в ходе клеточного цикла. Поэтому закономерно предположить, что хромомер не может быть постоянной структурной единицей генома и для каждого этапа онтогенеза существуют

свои наборы хромомеров.

Гигантские (политенные) хромо омы. Длина этих хромосом больше таковой у хромосом многих инт рфазных кл ток в 100-200 раз, толщина – в

1000 раз.

Первое доказательство сущ ствования гигантских хромосом получено в 1881 г. Е. Бальбиани, который обнаружил их в клетках слюнных желез мотыля

(Chironomus).

У личин к Drosophila melanogaster общая длина четырех пар хромосом в слюнных железах равна 2000 мкм, а в соматических клетках аналогичная

Причины характерных ф рм и размеров гигантских хромосом:максимальная деспирализация;

многократное воспроизведение хромосом без последующего расхождения.

Участки более плотной спирализации хромонем (хромомеры) на гигантских хромосомах представлены в форме поперечной исчерченности – дисков. Такие политенные хромосомы далее не воспроизводятся и находятся в состоянии соматической конъюгации гомологов, достигающей идеальной точности.

Диски и междисковые участки гомологов расположены строго параллельно и на большом протяжении хромосом тесно сближены. Такая конъюгация не характерна для хромосом подавляющего большинства соматических клеток. Возможность четко различать детали строения гигантских хромосом в дальнейшем была использована Т. Пайнтером для изучения их перестроек и характера конъюгации хромосом.

Генетика с основами биометрии

Хромосомы типа «ламповых щеток» открыты В. Флеммингом в 1878 г.

Хромосомы этого типа являются результатом длительного мейотического деления, продолжительность которого может составлять несколько месяцев. В течение этого времени хромосомы пребывают в сильно декомпактизованном состоянии и их можно наблюдать в световой микроскоп. На более поздних стадиях мейоза хромосомы становятся компактными.

Флемминг со своим студентом, изучая развитие ооцитов у амфибий и рыб, столкнулись со «странными тонкими структурами» в окрашенных срезах ядер ооцитов аксолотля Siredon pisciformis, находящихся на ранних стадиях развития. Рисунок этих хромосом был опубликован в 1882 г. На нем были изображены ядра, содержащие толстые осевые тяжи, с отходившими от них тонкими радиальными нитями.

У. Дюрие в 1941 г. показал, что в состав этой хромосомы входит длинная нить, с расположенными на ней парными гранулами (хромомерами) размером 1-2 мкм, от которых отходят петли (рисунок 2).

Рисунок 2 – Сх ма стро ния бивал нта типа «ламповых щеток», пр дстав нная Дюрие

В наше время б ьшие успехи в исследованиях хромосом этого типа достигнуты Дж. Г м и X. Кэ аном. Благодаря им стало известно, что хромомеры различных размеров регулярно опознаются в одних и тех же положениях в хр м ме т препарата к препарату. Именно хромомеры и нити между ними держат ДНК.

Благодаря наличию петель с сильно различающейся морфологией стала доступной быстрая идентификация хромосомы в целом, так и отдельного ее участка, что соответственно, упростило картирование хромосом данного типа.

Петли хромосом типа «ламповых щеток» по характеру накопления

Генетика с основами биометрии

ÏолесÃÓРисунок 3 – Некоторые характерные типы петель и связанных с ними

хромомеров в хромосомах типа «ламповых щеток»

Все хромосомы типа «ламповых щеток» состоят из пары хроматид, что можно наблюдать при механическом растяжении хромосомы с помощью микроманипулятора. Такой подход к изучению структурной организации хромосом показал, что материал петли выходит из одного хромомера и входит в соседний, а затем эти хромомеры ливают я в один в нерастянутой хромосоме. То есть петля – это м жхромом рный промежуток хромосомы, а пара петель, выходящих из одной и той же пары хромомеров, – это две хроматиды.

Каждая пет я от ича тся дово ьно сложным строением – состоит из нитевидной сердцевины, окруж нной накопленными в данном районе продуктами активности. От нача а до конца петли накопление продуктов происходит асимметрично.

Классическ распреде ение матрикса – по длине всей петли. При этом ясно различаются т лстый и тонкий концы петли, толщина матрикса постепенно нарастает т т нк го конца к толстому и, достигнув максимума, больше не увеличивается. Производное этого типа организации: транскрипционная единица в петле расположена также полярно, однако в ее начале и конце имеются нетранскрибируемые участки. Есть петли, включающие две или более транскрипционные единицы противоположной полярности, расположенные либо «голова к голове» (голова – точка начала транскрипции), либо «хвост к хвосту» (хвост – участок терминации транскрипции).

Возможности использования хромосом типа «ламповых щеток» значительно увеличились благодаря результатам исследований, полученным в 1998 г. Дж. Голлом и К. Морфи. Ими установлена возможность искусственного индуцирования «ламповых щеток», например, посредством инъецирования головки спермия в ооцит, в котором изначально имелись хромосомы этого типа. В этом случае из ДНК спермия формируются хромосомы типа «ламповых щеток», число которых идентично числу

Генетика с основами биометрии

хромосом гаплоидного набора вида. Не исключено, что такие хромосомы в скором будущем начнут получать после инъекций спермиев млекопитающих, и в первую очередь человека, что позволит картировать хромосомы с высоким уровнем разрешения.

2. Упаковка ДНК в разных ядерных структурах, в том числе в хромосомах

В таблице 1 приведены результаты расчетов, которые дают представление об особенностях упаковки ДНК в различных ядерных

Есть мнение, что к мпактизация ДНК, являющаяся причиной уплотнения тела мит тической хромосомы, проходит через несколько структурных ур вней (рисун к 4).

Уровень I – нукле мный – ведет к сверхскручиванию ДНК по поверхности гистоновой сердцевины.

Уровень II – нуклеомерный, называемый также сверхбусиной – 6 нуклеосом объединяются в глобулу.

Так как эти этапы компактизации осуществляются на огромных линейных молекулах ДНК, то ряд сближенных нуклеомеров и образует 30нанометровую фибриллу.

Уровень III – хромомерный – петли ранее отмеченных 30-нанометровых фибрилл, которые объединены «скрепками» из негистоновых белков, образуют компактные тела (0,1-0,2 мкм), дающие при искусственной деконденсации розетковидные структуры. Расположение петлевых доменов и хромомеров может быть неравномерным: участки тела митотической хромосомы, обогащенные ими, могут соответствовать полосам при дифференциальной окраске хромосомы.