Volkova EM Kaspirovich DA Genetika s osnovami biometrii EUMK

Генетика с основами биометрии

поражающих бактерии. Число и внутригенная локализация интронов характерны для каждого гена, что становится очевидным в результате сравнения организации гомологичных генов у разных видов.

Некоторые гены содержат только один-два интрона, но часто их значительно больше. Так, например, в гене овальбумина курицы 7 интронов, в гене сывороточного альбумина крысы их 13, а один из генов коллагена курицы имеет даже 51 интрон (рисунок 4).

Рисун к 4 – Примеры генов различным числом интронов

У чел века известно ишь немного генов, которые лишены интронов (таблица 2). Главным браз м это митохондриальные гены и несколько групп ядерных ген в: гены гист нов, гены малых РНК, гены гормональных рецепторов, пр цессир ванные копии интрон-содержащих генов и некоторые другие. В большинстве же своем гены человека имеют мозаичную структуру, т. е. состоят из экзонов и интронов.

Таблица 2 – Непрерывающиеся гены человека

Генетика с основами биометрии

Длина интрона может быть разной – от нескольких десятков пар нуклеотидов до многих тысяч. Общая длина в ех интронов часто значительно превышает суммарную длину экзонов. К примеру, из приблизительно 7 т.п.н., образующих ген овальбумина, на долю экзонов приходится всего 1872 п.н, т.е. почти, 3/4 длины составляют интроны. И л дования показывают, что только 1% ДНК генома приходится на экзоны и 24% – на интроны, при этом размер гена (экзоны + интроны) составля т около 28 т.п.н.

Интроны транскрибируются наравне с экзонами, так что про-мРНК содержит участки, транскрибированные как с экзонов, так и с интронов. В дальнейшем в ходе процессинга, происходящего в ядре, участки про-мРНК, соответствующие интр нам, вырезаются, а бывшие разобщенными участки, считанные экз н в, «сращиваются», и зрелая мРНК содержит только транскрипты экз н в. Эти прежде разобщенные участки соединяются в нужном порядке. Интр ны всегда (установлено для генов, кодирующих белки) имеют на 5'-к нце пару п след вательностей СТ, а на 3'-конце – AG.

Последовательности нуклеотидов в экзонах консервативны, а в интронах сильно варьируют. Иногда экзон одного гена может быть гомологичным экзону даже другого гена. Например, два β-глобиновых гена мыши имеют по три гомологичных экзона в каждом гене. Между интронами этих генов гомология не найдена, по-видимому, из-за того, что интроны эволюционируют значительно быстрее, чем экзоны. При сравнении последовательностей нуклеотидов в одних и тех же генах у разных видов находят большую гомологию в экзонах.

Разные экзоны в пределах гена не только различаются по составу кодируемых ими аминокислот, но и имеют определенные структурные особенности. Например, в геноме человека обнаружено 30-45 тыс. так называемых CpG-островков. Это тяжи неметилированной ДНК с высоким содержанием динуклеотидов CpG. Чаще всего они располагаются в районах

Генетика с основами биометрии

стартовых точек транскрипции. Вероятность найти CpG-островки в первых экзонах генов человека в 13 раз выше, чем в интронах, и в два раза выше, чем в других экзонах.

Общий план строения генов у прокариот и эукариот не отличается. И те, и другие содержат регуляторную область с промотором и оператором, единицу транскрипции с кодирующей и нетранслируемыми последовательностями, а также терминатор. Однако организация генов у прокариот и эукариот отличается. Для прокариот характерно объединение нескольких генов в единую функциональную единицу – оперон (рисунок 5). В

начале и в конце оперона есть единые регуляторные области для нескольких

структурныхÏолесÃÓгенов. Рисун к 5 – Строение генов у прокариот

С транскрибируем го участка оперона считывается одна молекула и- РНК, кот рая с держит несколько кодирующих последовательностей, в каждой из к т рых есть св й старт- и стоп-кодон. С каждого из таких участков синтезируется один белок. Таким образом, с одной молекулы и-РНК синтезируется несколько молекул белка.

Работу оперона могут регулировать другие гены, которые могут быть заметно удалены от самого оперона – регуляторы. Белок, транслируемый с этого гена называется репрессор. Он связывается оператором оперона, регулируя экспрессию сразу всех генов, в нем содержащихся. Такое сопряжение не встречается у эукариот из-за наличия у них ядерной оболочки, отделяющей цитоплазму, где происходит трансляция, от генетического материала, на котором происходит транскрипция. У прокариот во время синтеза РНК на матрице ДНК с синтезируемой молекулой РНК может сразу связываться рибосома. Таким образом, трансляция начинается еще до завершения транскрипции. Более того, с одной молекулой РНК может одновременно связываться несколько рибосом, синтезируя сразу несколько

Генетика с основами биометрии

молекул одного белка.

У эукариот практически не встречается объединение генов в опероны. Однако кодирующая последовательность гена эукариот чаще всего разделена на транслируемые участки – экзоны, и нетранслируемые участки – интроны (рисунок 6). С каждого гена сначала синтезируется не зрелая, или пре-РНК, которая содержит в себе как интроны, так и экзоны.

После этого проходит процесс сплайсинга, в результате которого интронные участки вырезаются, и образуется зрелая иРНК, с которой может быть синтезирован белок. Такая организация генов позволяет, например,

осуществить процесс альтернативного сплайсинга, когда с одного гена могут быть синтезированыÏолесÃÓразные формы белка, за счет того, что в процессе сплайсинга экзоны могут сшиваться в разных последовательностях. Исходя из

вышесказанного, можно сделать вывод, что гены эукариот и гены прокариот имеют ряд отличительных особенностей (рисунок 7).

Рисун к 6 – Строение генов у эукариот

Рисунок 7 – Сравнение строения генов прокариот и эукариот

Генетика с основами биометрии

3. Сплайсинг и альтернативный сплайсинг

Сплайсинг – процесс вырезания определенных нуклеотидных последовательностей из молекул РНК и соединения последовательностей, сохраняющихся в «зрелой» молекуле, в ходе обработки РНК. Наиболее часто этот процесс встречается при созревании матричной или информационной, РНК (мРНК) у эукариот, при этом путем биохимических реакций с участием РНК и белков из мРНК удаляются участки, не кодирующие белок (интроны) и соединяются друг с другом кодирующие аминокислотную последовательность участки – экзоны. Таким образом, не зрелая пре-мРНК превращается в зрелую мРНК, с которой считываются (транслируются) белки клетки (рисунок 8).

Большинство генов прокариот, кодирующих белки, не имеют интронов, поэтому у них сплайсинг пре-мРНК встречается редко. У представителей эукариот, бактерий и архей встречается также сплайсинг транспортных РНК

(тРНК) и других не кодирующих РНК.

Сплайсинг осуществляется сплайсосомой – массивной структурой, в

ÏолесÃÓРисун к 8 – процесс альтернативного сплайсинга

состав которой входит 5 малых ядерных нуклеопротеидных частиц (snRNP) – U1, U2, U4, U5 и U6 (U3 не участвует в сплайсинге) – из-за большого количества вспомогательных белков. Вместе они способны точно распознать сайты сплайсинга и катализировать 2 шага реакции сплайсинга.

Пре-мРНК некоторых генов эукариот могут подвергаться альтернативному сплайсингу.

Альтернативный сплайсинг – это образование разных мРНК из одной и

Генетика с основами биометрии

той же пре-мРНК, синтезированной с одного гена. Большинство генов в эукариотических геномах содержат экзоны и интроны. После транскрипции в процессе сплайсинга интроны удаляются из пре-мРНК, а вот экзон может включаться (или нет) в состав конечного транскрипта. Таким образом, с помощью альтернативного сплайсинга можно получить множество транскриптов, а, следовательно, и белков. Объединение различных сайтов сплайсинга позволяет индивидуальным генам экспрессировать множество мРНК, которые кодируют белки, порой, с антагонистическими функциями. Экзон одного варианта сплайсинга может оказаться интроном в

альтернативном пути. Разные варианты сплайсинга могут приводить к образованиюÏолесÃÓразных изоформ одного и того же белка.

Предположительно у эукариот альтернативный сплайсинг может быть важным эволюционным достижением: повысилась эффективность хранения информации. Недавно было показано, что у примерно 95% мультиэкзонных генов человека наблюдается альтернативный сплайсинг. Геном круглого червя Caenorhabditiselegans по количеству генов практически не отличается от генома человека, однако альтернативному плай ингу подвергаются премРНК только 15% генов. Таким образом, альтернативный сплайсинг позволяет увеличить разнообразие белковых продуктов генов, сохраняя при этом относительно небольшое колич ство различных генов в геноме и не создавая избыточных копий генов.

Разные варианты альт рнативного сплайсинга одной пре-мРНК могут осуществляться в разные п риоды развития организма и в разных тканях, а также у разных особей одного вида.

Существует неск ько механизмов альтернативного сплайсинга:

1. Пр пуск экз на и и экзонной кассеты: в этом случае экзон может вырезаться из первичн г транскрипта или сохраняться в н м. Это наиболее часто используемый механизм у млекопитающих;

2. Взаим исключающие экзоны: из двух экзонов в конечном транскрипте сохраняется только один;

3. Использование альтернативного донорного сайта: есть несколько альтернативных 5'-участков сплайсинга (донорных сайтов), что изменяет 3'- границу вышележащего (upstream) экзона;

4. Использование альтернативного акцепторного сайта: используются разные 3'-участки сплайсинга (акцепторные сайты), что меняет 5'-границы нижележащего (downstream) экзона.

5. Удержание интрона: интрон сохраняется в последовательности транскрипта. Если интрон находится в кодирующей последовательности, то он может кодировать стоп-кодон или же сдвигать рамку считывания. А это может привести к потере функциональности белка, поэтому данный механизм альтернативного сплайсинга используется крайне редко у млекопитающих.

Помимо описанных основных механизмов альтернативного сплайсинга

Генетика с основами биометрии

существует еще 2 других механизма, благодаря которым разные мРНК могут получаться из одного гена: множественные промоторы и множественные сайты полиаденилирования. Транскрипция может начинаться с разных точек. В результате получаются транскрипты с разными экзонами на 5’-конце (множественные промоторы). Множественные сайты полиаденилирования обеспечивают разные 3’-концы для транскрипта. Оба механизма найдены в комбинации с альтернативным сплайсингом и добавляют разнообразия в типы мРНК, полученных от одного гена (рисунок 9).

ÏолесÃÓРисунок 9 – Механизмы альтернативного сплайсинга

Генетика с основами биометрии

4.5 ТРАНСКРИПЦИЯ ПЛАН

1. Этапы биосинтеза РНК.

2. Транскрипция.

3. Организация промоторных и терминаторных участков у про- и эукариот.

4. Процессинг первичных транскриптов у эукариот.

5. Обратная транскрипция.

1.ÏолесÃÓЭтапы биосинтеза РНК

Одним из важных процессов пластического обмена является биосинтез

белка. Он протекает во всех клетках. Аминокислотная последовательность в молекуле белка зашифрована в виде нуклеотидной последовательности в молекуле ДНК и называется генетическим кодом. Участок молекулы ДНК, ответственный за синтез одного белка, называет я геном.

Для биосинтеза белка необходима генетиче кая информация молекулы ДНК. Информационная РНК – перено чик этой информации из ядра к месту синтеза. Рибосомы – органоиды, где прои ходит синтез белка, набор аминокислот в цитоплазме; транспортные РНК, кодирующие аминокислоты и переносящие их к месту синт за на рибосомы. АТФ – вещество,

обеспечивающее энергией проц сс кодирования и биосинтеза.

Выделяют едующие этапы биосинт за:

Транскрипция – пр цесс биосинтеза всех видов РНК на матрице ДНК,

который пр текает в ядре.

Определенный участ к мо еку ы ДНК деспирализуется, водородные связи между двумя цеп чками разрушаются под действием ферментов. На одной цепи ДНК, как на матрице, по принципу комплементарное из нуклеотидов синтезируется РНК-копия. В зависимости от участка ДНК таким

образом синтезируются рибосомные, транспортные, информационные РНК.

После синтеза иРНК она выходит из ядра и направляется в цитоплазму к

месту синтеза белка – на рибосомы.

Биосинтез белка состоит из ряда реакций:

активирование и кодирование аминокислот. тРНК имеет вид

клеверного листа, в центральной петле которого располагается триплетный антикодон, соответствующий коду определенной аминокислоты и кодону на иРНК. Каждая аминокислота соединяется с соответствующей тРНК за счет энергии АТФ. Образуется комплекс тРНК-аминокислота, который поступает на рибосомы;

Генетика с основами биометрии

сборка полипептидной цепи, тРНК с аминокислотами по принципу комплементарности антикодона с кодоном соединяются с иРНК и входят в рибосому. В пептидном центре рибосомы между двумя аминокислотами образуется пептидная связь, а освободившаяся тРНК покидает рибосому. При этом иРНК каждый раз продвигается на один триплет, внося новую тРНКаминокислоту и вынося из рибосомы освободившуюся тРНК. Весь процесс обеспечивается энергией АТФ. Одна иРНК может соединяться с несколькими рибосомами, образуя полисому, где идет одновременно синтез многих молекул одного белка. Синтез заканчивается, когда на иРНК начинаются

бессмысленные кодоны (стоп-коды). Рибосомы отделяются от иРНК, с них снимаются полипептидные цепи. Так как весь процесс синтеза протекает на гранулярной эндоплазматической сети, то образовавшиеся полипептидные цепи поступают в канальце ЭПС, где приобретают окончательную структуру и превращаются в молекулы белка;

концов ÏолесÃÓхромосомы, инактивации Х- хромосомы, транспорта белков из ядра в цитоплазму.

Все реакции синтеза катализируются специальными ферментами с затратой энергии АТФ. Скорость синтеза велика и зависит от длины

полипептида.

2. Транскрипция

Все процессы, которые прои ходят в клетке возможны благодаря

синтезу белков. А синтез б лков возмож н благодаря существованию РНК.

РНК синтезируется ф рм нтом ДНКполимеразой.

Транскрипция – синт з вс х типов РНК по матрице ДНК, который

осуществляется ферментом ДНКпо имеразой.

осуществляется с участием с ответствующих ферментов РНК-полимераз, и большой группы белк в – регуляторов транскрипции.

Типы, синтезируемые РНК:

Общая характеристика процесса транскрипции:

1.Транскрибируется только одна нить в молекуле ДНК.

2.Синтез цепи РНК идет в направлении 5′ → 3′ (рисунок 1).

3.РНК синтезируется комплементарно и антипараллельно транскрибируемой нити ДНК.

Генетика с основами биометрии

4.В связанном с ДНК состоянии постоянно находится не более 9-10 нуклеотидов.

5.Свободный 5′ - конец РНК в ходе синтеза отделяется.

6.В ДНК в расплетенном состоянии постоянно находится не более 18-20 нуклеотидов.

ÏолесÃÓУзнавание пр м т ра.Инициа изация.

Рисунок 1 − Синтез цепи РНК и ДНК

Строящаяся цепь РНК имеет направление 5′-3′, т. . нуклеотиды у этой

цепи присоединяются к 3′ концу. По отношению к матричной цепи ДНК строящаяся цепь РНК антипараллельна, поэтому она транскрибируется ферментом в направлении 3′ →5′.

Смысловая цепь ДНК (5′) – ТТЦ-АГТ-ЦАГ-ГАЦ-ГАТ-АЦТ – (3′) Матричная цепь ДНК (3′) − ААГ-ТЦА-ГТЦ-ЦТГ-ЦТА- ТГЦ − (5′)

↓ ТРАНСКРИПЦИЯ Матричная РНК (5′) – УУЦ- АГУ-ЦАГ-ГАЦ-ГАУ-АЦГ – (3′)

↓ ТРАНСЛЯЦИЯ

Пептидная цепь бе ка (NH2) = Ф н- С р-Гло-Асп-Асп=(СООН)

Схема Принцип записи и р а изации г н тической информации

Механизм транскрипции состоит из 4 этапов:

Эл нгация.

Терминация (рисунок 2).

Инициация – браз вание фосфодиэфирной связи между двумя рибонуклеотидами.

Элонгация – последовательное удлинение растущей цепи РНК. Терминация (окончание транскрипции) определяется особой

нуклеотидной последовательностью ДНК.

Транскрипция ДНК происходит в определенных участках молекулы – транскриптонах. Транскриптон ограничен последовательностью ДНК – зоной начала транскрипции, которая называется промотором и зоной остановки

транскрипциитерминатором.

Процесс транскрипции обеспечивает фермент ДНК – зависимая РНКполимераза. У бактерий синтез мРНК, рРНКи Трнк осуществляется одной и той же РНК-полимеразой. Общее количество молекул этого фермента в клетках Е.coli может достигать около 7000. Наиболее полно изучена РНКполимераза E.coli, структура которой аналогичны структуре этого фермента у