Volkova EM Kaspirovich DA Genetika s osnovami biometrii EUMK

Генетика с основами биометрии

8.2 ГЕНОТЕРАПИЯ

ПЛАН

1.Основные принципы и методология генотерапии.

2.Достижения, перспективы и проблемы генной терапии.

1. Основные принципы и методология генотерапии

В широком смысле слова генная терапия – это лечение, основанное на введении в ткани или в клетки пациента смысловых последовательностей ДНК. ПервыеÏолесÃÓпредставления о практических аспектах и возможностях использования генной терапии были несколько ошибочными. Например, думали, что посредством генотерапии будут исправляться дефекты в генах. В качестве основного объекта для такого лечения рассматривали моногенные наследственные заболевания человека. Не исключали возможность коррекции генного дефекта в соматических и зародышевых клетках.

На самом деле оказалось:

значительно проще вводить в организм пациента полноценно работающий ген (как правило – это его кДНК);

в норме экспр ссия д ф ктного гена происходит именно в соматических тканях. Генная т рапия на уровне половых и зародышевых клетках сопряжена с бо ьшим риском с рь зных последствий для генофонда человечества;

генная терапия – это эффективный способ борьбы как с моногенными нас едственными заболеваниями, так и с широко распространенными б езнями (з окачественными опухолями, многими вирусными инфекциями, патологиями сердечно-сосудистой системы и другими).

В временн м п нимании генная терапия – это лечение наследственных, онкологических, некоторых инфекционных (вирусных) и других заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов либо придания клеткам новых функций.

Первые клинические испытания методов генной терапии:

 май 1989 г. – маркирование опухоли-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы;

 сентябрь 1990 г. – в Бетезде (США) 4-летней девочке, страдающей наследственным иммунодефицитом (частота встречаемости – 1:100000), обусловленным мутацией в гене аденозиндезаминазы, пересажены ее собственные лимфоциты, предварительно трансформированные ex vivo геном АDА (ген АDА + ген nео + ретровирусный вектор). В течение трех лет терапии

вобщей сложности проведено 23 внутривенных трансфузии АDА-

Генетика с основами биометрии

трансформированных Т-лимфоцитов без видимых неблагоприятных эффектов. Результат нового подхода к борьбе с этим редким заболеванием – улучшение состояния пациентки, возвращение ее к нормальному образу жизни.

Результативное использование генной терапии в медицине во многом стало возможным благодаря успехам молекулярной биологии, инструменты которой позволили:

 картировать гены, мутации которых приводят к наследственным заболеваниям;

 выяснять молекулярную природу этих мутаций;  секвенировать и клонировать гены;

ÏолесÃÓсоздавать генно-инженерные конструкции с последующей их доставкой в клетку.

Следует также отметить, что качественному скачку в области генной терапии поспособствовало доказательство ее безопасности, установленной по результатам первых исследований.

В то же время до сих пор недостаточно изучены последствия манипулирования генами или рДНК іn vivо.

Введение в организм человека по ледовательностей ДНК, которые не находятся под контролем свойственных им регуляторных элементов – это вероятная причина непредсказу мых изм н ний метаболических процессов на фоне функционального дисбалан а. Е ть мнение, что современные представления структуре г нома и го взаимодействиях с экзогенными ДНК и вирусными пос едоват ьностями (в кторами, используемыми в генной инженерии) пока недостаточны для прогнозирования возможных нежелательных и и нек нтро ируемых последствий. Поэтому до использования пр грамм генной терапии следует удостовериться в их безопасности для сам го пациента и для популяции в целом. Как минимум ожидаемый лечебный эффект или возможность получения дополнительной полезной инф рмации д лжны преобладать над потенциальным риском предлагаемой процедуры.

Обязательные разделы программ генной терапии для клинических испытаний:

 определение типа клеток, которые подлежат генетической модификации;

 обоснование выбора нозологии для проведения курса генной терапии;

схема конструирования экзогенной ДНК;

обоснование биологической безопасности вводимой генной конструкции, включающее опыты на культурах клеток и на модельных (трансгенных) животных;

способ переноса генной конструкции в клетки пациента;

методы анализа экспрессии введенных генов;

Генетика с основами биометрии

оценка клинического (терапевтического) эффекта;

возможные побочные последствия и их профилактика.

Особое внимание в программе генной терапии уделяется анализу последствий проводимых процедур. Этот контроль проводится на каждом этапе терапии, причем исследования выполняются на различных уровнях.

После переноса гена отыскиваются модифицированные клетки, и изучается их динамика в определенных тканях. С целью облегчения такого поиска в генетические конструкции включаются гены-маркеры. В последнее время последовательности экзогенной ДНК в модифицированных клетках

количественной оценки соответствующего РНК-транскрипта либо белкового продукта гена. При возможности анализируется коррекция первичного биохимического дефекта. Проводится сопоставление полученных данных с результатами комплексного медицинского обследования, исправляется и дополняется схема лечения.

Типы генотерапевтических вмешатель тв. Выбор клеток-мишеней. Клетки, в которые вводятся последовательно ти ДНК, называются клетками-

мишенями.

Генная терапия позволяет:

 корректировать насл д тв нные патологии – последствия генетических дефектов;

 придавать к еткам новые функции, способствующие исключению патологий.

В перв м случае в рганизм вводится нормально работающий гомолог дефектного гена.

В осн ве вт р го п дх да ежит использование генов, обладающих условным цит т ксическим эффектом или способствующих формированию выраженного иммунн го твета (применяют при лечении опухолей или инфекций). Мишенями для таких генов служат пораженные ткани, иммунные клетки, специфическим образом проникающие в эти ткани, либо предварительно трансформированные іn vitro другие клетки. Таким образом, в зависимости от характера заболевания и предполагаемого генотерапевтического подхода объектом генетической трансфекции могут служить самые разные соматические клетки, как несущие дефектный ген, так и нормальные клетки, приобретающие терапевтические свойства после трансфекции.

Генная терапия проводится или в культуре клеток (еx vivo), или в организме (іn vivo), что определяется способом введения экзогенных ДНК в геном.

В первом случае выделяются и культивируются специфические типы клеток пациента. После в них вводятся чужеродные гены, отбираются

Генетика с основами биометрии

трансфецированные клетки, которые вводятся тому же пациенту. Сегодня большинство программ генной терапии основано именно на этом подходе. Факторы, ограничивающие реализацию таких программ: возможны лишь в крупных специализированных центрах, большие материальные затраты и необходимость в высоких биотехнологиях.

Во втором случае осуществляется прямое введение клонированных и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в специфические ткани больного. Вводимые ДНК обычно интегрируются с молекулами, обеспечивающими их адресную доставку в клетки-мишени. Этот

подход на перспективу найдет широкое применение в массовом лечении распространенныхÏолесÃÓзаболеваний. Пока он используется в борьбе с

муковисцидозом.

Этапы генной терапии (рисунок 1):

1. Получение клеток от больного. Использование собственных

клеток пациента (аутологичных клеток) исключает вероятность развития иммунного ответа после инфузии или трансплантации (1).

Методы генетической трансфекции в генной терапии.

Трансфекция – это искусственное введение в клетки эукариот изолированных молекул ДНК. Условия, обеспечивающие успех генотерапии:

эффективная доставка чужеродного гена в клетки-мишени;

Генетика с основами биометрии

длительная персистенция гена в клетках-мишенях;

экспрессия – полноценная работа введенного гена.

При трансфекции используются: чистые («голая» - naked) ДНК, лигированные в плазмиду; комплексированные ДНК – плазмидные ДНК, комплектованные с солями, белками (трансферрином), органическими полимерами (декстраном, полилизином), липосомами или частицами золота; ДНК, входящие в состав вирусных частиц, предварительно лишенные способности к репликации.

Чтобы персистенция была длительной, чужеродная ДНК в клеткахреципиентах должна встроиться в геном – в ДНК клетки-хозяина. Экзогенная ДНК элиминируетсяÏолесÃÓ, если она в ядре находится в свободном состоянии. Экспрессия чужеродной ДНК возможно лишь при наличии соответствующих промоторов.

Чужеродные гены доставляются в клетки посредством химических, физических и биологических методов.

Эффективность введения чужеродных генов in vitro обеспечивают такие физические способы как электропорация, бомбардировка частицами золота, а также практически все виды биологиче кой до тавки. В то же время реальная интеграция в геном клетки-реципиента до тигается, если используются ретровирусные или аденоассоциированные вектора, так как они имеют свойства, необходимые для встраивания в эукариотическую ДНК.

Лишь вирусные векторы и и г н тич ские конструкции с вирусными последовательностями способны к активной трансфекции, а в ряде случаев – и к длительной экспрессии чужеродных генов.

2. Достижения, перспективы и проблемы генной терапии

Как и ранее, к нцепция генной терапии вызывает многочисленные споры. Ее ст р нники уверены, что это лечение вытеснит традиционные подходы к б рьбе заб леваниями. Противники акцентируют внимание на недостаточной изученности последствий изменения генома.

Успехи, достигнутые в генной терапии:

 нормализация работы онкогенов и супрессоров опухолей;  обучение иммунной системы распознавать антигены раковых

клеток. Этот принцип стал основой для создания противоопухолевых вакцин;  получены первые положительные результаты применения нового

способа лечения некоторых нейродегенеративных заболеваний (болезни Паркинсона, хорея Гентингтона), в основе которого лежит введение в

определенные подкорковые отделы мозга культуры клеток, синтезирующих набор белков, препятствующих дегенерации нервных клеток;

 разработаны генотерапевтические подходы к лечению ВИЧинфекции.

Генетика с основами биометрии

В генной терапии не только совершенствуются существующие, но и разрабатываются новые методы введения чужеродных ДНК в клеткиреципиенты. Например, для борьбы с генными болезнями іn vivo предложены аэрозольные и инъецируемые вакцины.

Аэрозольная генотерапия на перспективу будет использоваться в массовом лечении пульмонологических заболеваний: муковисцидоза, эмфиземы, рака легких. В этом случае осуществляется генетическая модификация специфических типов клеток легких.

Инъецируемые вакцины позволят работать с разными типами клеток, то

есть они станут распространенным и универсальным способом доставки чужеродных ДНК в любые ткани.

клеткамиÏолесÃÓущемляется право будущих поколений на наследование немодифицированного генома.

Не исключено, что в скором будущем станет доступной генетическая модификация предшественников дифференцированных клеток – стволовых клеток. В качестве такой перспективы выступает трансформация тотипотентных эмбриональных стволовых клеток, которые при определенных

условиях могут стать любыми соматическими клетками.

Многими генно-инженерными лабораториями, центрами, фармацевтическими фирмами потрачено немало ил на поиск и создание

векторов. В то же время до сих пор нет векторов, обеспечивающих 100процентную трансфекцию (как ex vivo, так и іn vivo) на фоне высокой пакующей способности, при которой включают я генетические конструкции размером от 1 до 1000 тыс. п.о.

Пока остается недоступной р гулируемая экспрессия. Остается открытый вопрос, касающийся уровня безопасности онкогенных

модификаций и других неже ате ьных побочных эффектов.

Коррекция генетических дефектов в зародышевых клетках – вероятная причина зас рения ген ф нда неже ательными искусственными генными

конструкциями.

Факт ры, препятствующие широкому использованию возможностей

3. Трудоемкость разработки и внедрения генотерапевтических подходов и другие.

Генетика с основами биометрии

9.ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СЕЛЕКЦИИ

9.1ГЕНЕТИКА КАК ТЕОРИТИЧЕСКАЯ ОСНОВА СЕЛЕКЦИИ

ПЛАН

1. Селекция как наука.

2. Исходный материал в селекции.

3. Системы скрещиваний в селекции.

4. Гетерозис.

хозяйственноÏолесÃÓ-ценными кач ствами ста и прибегать к искусственному отбору. Первые селекци нные мероприятия имели место почти 6000 лет назад в Эламе (Двуречье). Свидете ьством этому служит изображение родословной лошадей, бнаруженн й на печатке. Ряд историков считает, что, что арабы

5. Методы отбора.

6. Подбор.

1. Селекция как наука

Селекция – это наука, которая изучает биологические основы и

разрабатывает методы создания и улучшения пород животных, сортов растений и штаммов микроорганизмов. Селекция разрабатывает конкретные

Изначально животных и раст ний начали разводить 8000-9000 лет назад на Ближнем Востоке, в Европе и Азии с льское хозяйство зародилось несколько

позже. Уже тогда це ью выв д ния пород животных и сортов растений с

начали искусственно пылять финиковые пальмы задолго до новой эры. Селекци нные приемы разведения животных использовались в Римской

империи, в Древнем Китае и Древнем Риме были разработаны рекомендации по отбору колосьев у злаков.

На первых порах селекция основывалась сугубо на отборе, который проводился бессознательно и длился не менее 10 лет.

Теоретическая база в те далекие времена отсутствовала, селекционеры полагались на свой опыт и интуицию. Совершенствование животных, растений строилось на учете свойств родительских форм, целенаправленная селекция как таковая не проводилась. В то же время нельзя не отметить, что до сих пор используются результаты работ селекционеров древнего мира:

лучшие сорта хлопчатника, возделываемые ныне, позаимствованы

укрестьян старых мексиканских деревень;

сорта льна-долгунца, выведенные в некоторых районах Пскова;

Генетика с основами биометрии

 сорта озимой и яровой пшеницы с ценными хозяйственными качествами, выведенные в давние времена.

Большое внимание в народной селекции уделялось и животноводству. До нас дошли ярославская и холмогорская порода крупного рогатого скота, воронежские битюги и мезенская лошадь, орловские рысаки, романовские и мериносовые овцы.

Отбор по хозяйственно-полезным признакам и свойствам без учета механизмов их наследуемости и изменчивости часто дает нежелательные результаты. Например, следствием отбора тонкорунных овец сугубо по

комолости является крипторхизма. Другой пример: отбор овец романовской породы свободных от пегости на шее отрицательно сказывается на их жизнеспособности.

ВÏолесÃÓстранах развитым животноводством, растениеводством, в том числе в Республике Беларусь селекционные программы стали дополнятся последними достижениями молекулярной генетики, генной инженерии. Например, в животноводстве нашла широкое практическое применение маркер-зависимая селекция, в основе которой лежит отбор родительских форм с лучшими аллельными вариантами генов, детерминирующих показатели продуктивности и устойчивость к заболеваниям. В селекцию растений интегрированы ГМ-культуры, характеризующиеся высокой урожайностью, устойчивостью к различным стресс-факторам, насекомым-вредителям, пестицидам, гербицидам.

С конца XVIII ст. в селекции начали применять научно-обоснованные приемы, учитывать тип наследования признаков (доминантный или рецессивный), тип доминирования, характер наследования (аутосомное или сцепленное с полом, независимое или сцепленное), тип и характер взаимодействия генов в онтогенезе, изучать генетику продуктивности

то сегодня она предпо ага т ц направл нное создание и совершенствование пород жив тных, с рт в растений, штаммов микроорганизмов.

Современная се екция – это поэтапная система:

1. Изучение исх дн го материала.

2. Разраб тка мет д в гибридизации с использованием современных генетических мет д в.

3. Разработка методов отбора.

Генетика с основами биометрии

2. Исходный материал в селекции

Исходный материал в селекции – это все многообразие диких и культурных форм данного вида животных или растений, по которому ведется селекция.

Нередко селекционеры в качестве исходного материала используют устойчивые к агрессивным природно-климатическим факторам, к заболеваниям; плодовитые, жизнеспособные дикие формы того или иного вида. Немало ныне известных домашних животных и культурных растений, родоначальниками которых являются дикие формы. Последние в чистоте не представляют интерес для сельского хозяйства, так как на фоне своей устойчивости к метным заболеваниям, климату имеют низкую продуктивность. Дикие формы скрещиваются с животными различной породной принадлежности для получения гибридного потомства, из которого для дальнейшего размножения отбираются лучшие особи.

Ученые, изучавшие географию генотипов животных и центров происхождения культурных растений:

1. Н.И. Вавилов – по результатам многочисленных экспедиций установил некоторые закономерно ти ра еления культурных растений. Например, ученый обнаружил, что дикая рожь у ебя на родине, в Гератском районе – это сорняк, засоряющий по вы пшеницы. В то же время на территории Северной Европы, где н возможно получение высоких урожаев пшеницы, это растение явля тся основной хлебной злаковой культурой.

(кокаиновый куст, хинное дерево).

Зная условия, в которых произрастает то или иное растение у себя на родине, можно установить и исключить неэффективные направления в

Генетика с основами биометрии

селекции.

2. А.С. Серебровский – изучал генотипы сельскохозяйственных животных с учетом места разведения. Так, ученый установил, что в северной части Европы практически весь крупный рогатый скот черный, а в южной – рыжий. На севере в сравнении с югом не встречается горбатый скот, носитель гена горбатости зебу, отсутствуют и курдючные овцы. Это позволяет сделать вывод, что различные природно-климатические зоны рознятся как по качественному составу составу генофонда, так и по концентрации определенных генов в популяции.

Благодаря достижениям молекулярной генетики созданы банки генов животныхÏолесÃÓ, в том числе видов, находящихся на грани исчезновения.

В качестве исходного материала в селекции используются мутации, в том числе спонтанные и индуцированные. Первые в естественных условиях возникают редко, что вызвало необходимость в поиске более перспективных

для селекции мутаций. Таковыми стали индуцированные мутации.

Мутагены, нашедшие практическое применение в селекции животных и

растений:

ионизирующие излучения;химические вещества.

Первые положительные р зультаты применения индуцированной ионизирующей радиации получ ны в п рвой половине XX ст. Например, были

получены первые радиомутанты пш ницы.

Облучению поддаются с м на, почки, пыльца. При этом облучение генеративных клеток дает мутации, закрепляющиеся половым путем, а облучение семян и п чек ведет к химеризации растений – формированию соматических мутаций, размножающихся вегетативным путем. Получены

сорта культур, материал м которым послужили индуцированные

рентгеномутации. Так й мутагенез не лишен недостатков. Один из них –

радиация вместно с мутациями может вызывать грубые хромосомные

поломки, приводящие к гибели растения.

В 30-х гг. XX ст. были проведены исследования, целью которых было установление особенностей влияния рентгеновских лучей на изолированную сперму кроликов и овец. В первом случае сперма или гибла, или теряла оплодотворяющую способность, во втором – рентгеновские лучи вели к значительному увеличению процента доминантных деталей. Эти результаты свидетельствуют о нерациональности использования индуцированной

рентгеномутации в животноводстве.

Индуцированный мутагенез дал положительные результаты в селекции насекомых. Например, облучение сделало возможным перенос аутосомного гена белой окраски у тутового шелкопряда на У-хромосому. Этот признак после мутагенеза наследуется сугубо женскими линиями, что облегчает отбор самцов, в коконе которых на 20-30% больше шелка.