Volkova EM Kaspirovich DA Genetika s osnovami biometrii EUMK

Генетика с основами биометрии

4.2 РЕПАРАЦИЯ ДНК

ПЛАН

1.Основные типы репарации ДНК.

2.Рестрикция-модификация ДНК.

1. Основные типы репарации ДНК

Репарация – процесс исправления ошибок в последовательности

нуклеотидов ДНК и восстановления ее исходной структуры.

ассоциированногоÏолесÃÓдля его активности небольшой молекулой РНК (10-15 нуклеотидов).

Механизм исправления ошибок включает в себя большое число ферментативных реакций. Молекула ДНК является единственной среди всех макромолекул, которая не деградирует, а исправляет возникающие повреждения. Репарация сохраняет первичную структуру и генетическую информацию ДНК, обеспечивает ее высокую стабильность и поддержание целостности клеточного генома. В результате из 1000 случайных изменений

ДНК в мутацию может реализовать я тати тиче ки менее одного случая.

Фотореактивация – восстанов ние исходной структуры молекулы

ДНК, поврежденных УФ-из уч ни м, в р зультате воздействия видимого

света. Она ткрыта И. Ф. К ва евым, А. Келнером и Р. Дульбекко в 1948 г. Эти ученые пр в ди и пыты над инфузориями, парамециями, коловратками,

бактериями и бактери фагами.

Факт ры, пределяющие эффективность фотореактивации: уровень рН;

температура; физи л гическое состояние клетки.

Восстановительный эффект при фотореактивации связан с действием

фермента дезоксирибозидпиримидинфотолиазы – полипептида,

Под влиянием УФ-лучей в одной цепи ДНК образуются димеры двух соседних пиримидинов (тиминовые димеры) циклобутанового типа. Каждый из димеров задерживает репликацию на 10 сек. Процесс регенерации оснований-мономеров активируется под действием видимого света с длиной волны 300–600 нм и осуществляется под действием специфических фотореактивирующих ферментов. Фотолиаза узнает димер и расщепляет ковалентные связи между двумя пиримидинами.

Фотореактивации подвергаются только циклобутановые димеры. На данный момент это единственная известная ферментная реакция, в которой

Генетика с основами биометрии

фактором активации служит не химическая энергия, а энергия видимого света. Дезоксирибозидпиримидинфотолиаза широко распространена у разных органических форм и имеется даже у таких примитивных микроорганизмов, как микоплазмы. Она есть у всех изученных бактерий, кроме Micrococcus radiodurans, которые чрезвычайно устойчивы к действию УФ-лучей и выдерживают дозы в 1000 раз более высокие, чем те, что летальны для E.coli. Фотолиаза обнаружена в клетках многих растений и животных, в том числе и у человека.

Эксцизионная репарация – удаление неправильно спаренных или поврежденных оснований из ДНК и синтез новых последовательностей, взамен ÏолесÃÓудаленных поврежденных. Данная репарация является наиболее распространенной. В ее основе лежит распознавание модифицированного основания различными гликозилазами, расщепляющими N-гликозидную связь этого основания сахарофосфатным остовом молекулы ДНК. С помощью данной репарации могут исправляться не только пиримидиновые димеры, но и многие другие повреждения структуры ДНК.

В эксцизионной репарации принимают уча тие несколько ферментов, а сам процесс затрагивает не только поврежденный, но и соседние с ним нуклеотиды. Для этой репарации необходима вторая (комплементарная) цепь ДНК. Общая упрощенная сх ма эк цизионной репарации представлена на рисунке 1.

Рисунок 1 – Схема эксцизионной репарации

Генетика с основами биометрии

Механизм эксцизионной репарации состоит из нескольких стадий:

1. Измененный участок, который несет повреждение в цепи ДНК, узнается и удаляется с помощью специфических ДНК-эндонуклеаз. Они осуществляют гидролиз фосфодиэфирных связей с 5'-конца от повреждения, а 5'→3' – экзонуклеаза и затем удаляют поврежденный участок.

2. Ресинтез ДНК – заполнение образовавшейся бреши, при этом одноцепочечный участок ДНК используется в качестве матрицы.

3. ДНК – лигаза ковалентно сшивает 3'-конец нового материала с 5'- концом старого материала.

Рекомбинационная репарация происходит с участием рекомбинации. Данный тип репарации основан на процессах рекомбинации и репликации, поврежденной ДНК.

Бреши в цепях ДНК образовываются в тех случаях, когда системы репарации оказываются нарушенными. Они имеют существенные размеры, что может привести к гибели клеток. В этом случае клетка может использовать механизм рекомбинации.

У бактерий в рекомбинантной репарации принимает участие белок Rec А. Данный белок связывается с одноцепочечным участком ДНК и вовлекает его в рекомбинацию с гомологичными уча тками неповрежденных цепей другой молекулы ДНК. В р зультате и разорванная (содержащая бреши), и неповрежденная цепи репариру мой мол кулы ДНК оказываются спаренными с неповрежденными компл м нтарными участками ДНК. При этом могут происходить вырезание опр д нного фрагмента и заполнение с его помощью бреши в дефектной ц пи. Возникающие при этом пробелы и разрывы в цепях ДНК в сп няются участием ДНК-полимеразы I и ДНКлигазы.

SOS-репарация – мед енная реп икация с участием системы ферментов, которую индуцирует блучение. М. Радман предположил существование этой системы в 1974 г. Она раб тает тогда, когда повреждений в ДНК становится настолько много, что угрожает жизни клетки. Для данного случая характерна индукция активности разнообразной группы генов, задействованных в различных клеточных процессах (таблица 1).

Таблица 1 – Гены, задействованные в SOS-репарации повреждений ДНК

Генетика с основами биометрии

Гены, определяемые количеством повреждений в ДНК, приводят к разным по значимости клеточным ответам (начиная со стандартной репарации поврежденных нуклеотидов и кончая подавлением клеточного деления).

Данный вид репарации наиболее изучен у Е. Сoli. Белки являются главными участниками, которые кодируются генами Rec A и Lex А.

Rec A представляет собой полифункциональный белок, который участвует в рекомбинации ДНК, регуляции транскрипции генов фага λ.

LexÏолесÃÓА – репрессор транскрипции большой группы генов, который предназначен для репарации ДНК бактерий. При его ингибировании или разрешении репарация активируется.

Связывание Rec А с Lex А приводит к расщеплению последнего и соответственно к активации генов репарации.

SOS-система репарации выявлена не только у бактерий, но и у животных и человека.

2 .Рестрикция-модификация ДНК

Система рестрикции-модификации – ф рментативная система бактерий,

разрушающая попавшую в кл тку чуж родную ДНК. Основная ее функция – защита клетки от чуж родного г н тич ского материала, например, бактериофагов и п азмид. Д я компон нтов системы характерны два типа активности – мети трансф разная (м тилазная) и эндонуклеазная. Система рестрикции-модификации специфична по отношению к определенным последовательн стям нук е тидов в ДНК, называемых сайтами рестрикции. Если нукле тиды в сайте рестрикции не метилированы, эндонуклеаза рестрикции вн сит в ДНК двуцепочечный разрыв (часто со смещением на несколько нукле тид в между цепями), при этом биологическая роль молекулы ДНК нарушается. Если ДНК в месте действия ферментов рестрикции метилирована, е расщепление не происходит. Подобная специфичность системы позволяет бактериям проводить селективное расщепление чужеродной ДНК, не затрагивая собственную. Функционирование системы можно рассмотреть на бактериофаге λ и клеток штамма E. Сoli K-12. Развитие фага приводит к эффективности посева равной единице: каждая частица бактериофага заражает бактериальную клетку, репродуцируется в ней и дает потомство.

Если фаголизатом, полученным после цикла развития фага λ на бактериях штамма E. Сoli K-12, инфицировать бактерии E. Сoli штамма C, то эффективность посева будет значительно ниже. Следовательно, не каждая фаговая частица по каким-то причинам способна размножаться в клетках нового хозяина. Если же фаговые частицы, образовавшиеся после цикла

Генетика с основами биометрии

репродукции на клетках E. Сoli C, использовать для заражения такой же культуры (E. Сoli C), то размножение бактериофага λ вновь будет проходить нормально, и эффективность посева составит единицу. Однако, если перед заражением штамма E. coli C фаг пропассировать на штамме E. Сoli K-12, то на штамме E. Сoli C он будет развиваться с низкой эффективностью. Таким образом, при смене хозяина наблюдается значительное ограничение размножения фага λ, которое получило название рестрикции.

Рестрикция обусловлена расщеплением инфицирующей ДНК фага под действием фермента, специфичного для штамма – хозяина. Ферменты эти

получили название рестриктаз. Благодаря своему нуклеазному действию они препятствуютÏолесÃÓподдержанию чужеродной ДНК в бактериальной клетке. С

другой стороны, если фаг проделал полный цикл репродукции в новом хозяине, то в дальнейшем в этом же хозяине, он не подвергается ограничению, или рестрикции. В бактериальной клетке кроме рестриктаз синтезируются другие ферменты – метилазы, которые призваны защищать собственную ДНК от действия клеточных рестриктаз. Метилазы изменяют или модифицируют собственную ДНК путем метилирования или гликозилирования аденина или цитозина. Этот процесс известен под названием модификации. Ферменты модификации защищают ДНК хозяина от дей твия эндонуклеаз рестрикции. При этом одна и та же мол кула мож т претерпевать разные типы модификации ДНК. Так, можно заразить мутант штамма E .Сoli B, утерявший способность к рестрикции, но сохранивший способность к модификации,

фагом λ K, несущим утяж яющую м тку. Методом центрифугирования в

градиенте плоскости и изатах таких кл ток можно обнаружить частицы

бактериофага, несущие дну из родительских цепей ДНК и совмещающие типы модификации, характерные д я штамма K и для штамма B.

Существенную р ь в модификации ДНК играет метионин. Если индуцировать лиз генный по фагу λ и ауксотрофный по метионину штамм E.

Сoli на среде без мети нина и добавить эту аминокислоту лишь в конце латентного периода, то ДНК в значительной части фагов модификации не затронут. Выяснилось, что в ходе модификации донором метильных групп служит S-аденозилметионин.

ДНК бактериофага, прошедшего полный цикл развития в новом хозяине, под действием метилаз модифицируется таким же образом, как и ДНК клеткихозяина. Она метилируется и приобретает свойства, защищающие ее от воздействия рестрикционных ферментов данного штамма бактерий. В настоящее время все известные рестриктазы в зависимости от потребностей в кофакторах и характеру расщепления нуклеотидных последовательностей

ДНК разделяют на 3 типа: I, II и III.

Рестриктазы I типа являются сложными белками с тремя различными типами субъединиц (эндонуклеаза, метилаза, фермент узнавания). Для действия этих ферментов требуются в качестве кофакторов АТФ, S-

Генетика с основами биометрии

аденозинмонофосфат и ионы Mg2+. Расщепление ДНК совмещено с гидролизом АТФ. Рестриктазы I типа узнают сайт рестрикции, но расщепляют последовательность ДНК на произвольном расстоянии от сайта узнавания (от нескольких десятков до нескольких тысяч п.о.). В результате образуются самые разнообразные фрагменты ДНК, или рестрикты. Такие рестриктазы невозможно использовать для решения генно-инженерных задач.

Системы рестрикции и модификации II типа представлены двумя отдельными белками (рестрикционная эндонуклеаза, модификационная метилаза).

Рестриктазы II типа – относительно просто организованные белки, состоящиеÏолесÃÓиз двух субъединиц одного типа со сравнительно небольшой молекулярной массой. Для специфического действия этих ферментов нужны

только ионы Mg2+. Рестриктазы II типа характеризуются тем, что у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают.

Рестриктазы III типа имеют некоторое сходство с рестриктазами I типа. Фермент состоит из двух различных субъединиц (эндонуклеаза, метилаза) и поэтому бифункционален, т.е. обладает как рестриктазной, так и метилазной активностью. Для проявления эндонуклеазной активности требуются только АТФ и ионы Mg2+. Ра щепление ДНК не сопровождается гидролизом АТФ. Рестриктазы III типа гидролизуют ДНК на расстоянии 20–39 нуклеотидных пар от сайтов узнавания и поэтому также довольно редко используются для практич ских ц й.

Генетика с основами биометрии

4.3 ЭВОЛЮЦИЯ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ О СТРУКТУРЕ И ФУНКЦИЯХ ГЕНА

ПЛАН

1. Хромосомная теория гена.

2. Функциональный и рекомбинационный тесты на аллелизм.

3. Центровая теория гена.

4. Псевдоаллелизм.

5. Цис-транс-тест на аллелизм.

Представление классической генетики о единице наследственности в основном базируется на положении о функциональной неделимости гена и стабильности структуры гена и генома.

Термин «ген» впервые применил В. Иоганнсен в начале XX в. для определения «особых, при изве тных об тоятель твах отделимых друг от друга и в силу этого до известной тепени амо тоятельных единиц, или элементов, в половых клетках», обу ловливающих свойства организма. Вопрос о локализации этих диниц долгое время оставался нерешенным. Предположение о том, что г ны локализуют я в хромосомах, впервые высказал А. Вейсман (1894 г.), а эксп рим нтально подтвердил Т. Морган (1911 г.), сформулировавший хромосомную т орию наследственности. Тем не менее В. Бэтсон (1909 г.), совр м нник Моргана, сомневался в том, что частички хр матина и и как й- ибо другой субстанции могут нести те же «силы», что и гены. С г асно представлениям хромосомной теории, ген является наименьшей структурной единицей наследственности, ответственной за формир вание пределенн го признака. Он локализуется в хромосоме и занимает стр го п ст янн место – локус. Однако это постоянство относительно, так как под влиянием различных факторов ген может менять положение, в результате чего изменяется и его фенотипическое выражение. Следовательно, ген – это и наименьшая функциональная единица наследственности, детерминирующая один элементарный признак организма и отвечающая за фенотипическое различие особей.

1.ÏолесÃÓХромосомная теория гена

Структура гена относительно постоянна, то есть под влиянием какихлибо воздействий может изменяться. Это приводит к формированию мутантного фенотипа и обусловливает возможность существования гена в двух или нескольких аллельных состояниях. Аллели оказывают различное действие на развитие и фенотипическое выражение признака. Значит, ген является также элементарной единицей мутации, т.е. единицей, способной как единое целое изменяться и в таком виде воспроизводиться в потомстве.

Генетика с основами биометрии

Согласно положениям классической генетики, ген не может быть разделен путем кроссинговера; рекомбинация возможна лишь между локусами хромосомы. Следовательно, ген является и наименьшей единицей рекомбинации. Кроме того, он способен к редупликации. Таким образом, в соответствии с хромосомной теорией наследственности, ген представляет собой участок хромосомы, выступающий как наименьшая неделимая единица функции, мутации и рекомбинации. Исходя из этого представления и учитывая, что ген контролирует развитие элементарных менделевских признаков, Морган ввел функциональный и рекомбинационный тесты определения аллельной принадлежности гена.

2.ÏолесÃÓФункциональный и рекомбинационный тесты на аллелизм

Функциональный критерий аллелизма основан на скрещивании мутантов и выяснении, нарушают ли мутации одну и ту же функцию или разные функции. Функциональный критерий аллелизма применим только к рецессивным мутациям.

Рисунок – 1 Функциональный критерий аллелизма. А – мутации в разных генах; Б – мутации в одном гене. Крестиками помечены мутации

Согласно этому критерию, если две мутации объединяются путем скрещивания в F1 и не поврежденные мутациями участки генетического материала взаимодействуют комплементарно, т. . образуется гибрид дикого типа, то мутации относятся к разным функциональным единицам – разным генам. В этом случае имеет место классическая дигетерозигота. Если же при объединении в F1 двух мутаций возникает гибрид мутантного фенотипа, это означает, что обе мутации повреждают одну и ту же функциональную единицу – один и тот же ген. В этом случае правомерно говорить о гетероаллельной комбинации, или компаунде.

Рекомбинационный тест на аллелизм сводится к определению возможности и частоты рекомбинаций между мутантными генами.

Генетика с основами биометрии

Рекомбинации возможны только в том случае, если мутации неаллельны. Если же мутации затрагивают один и тот же локус, они не рекомбинируют, поскольку кроссинговер происходит лишь между генами.

Функциональный и рекомбинационный тесты оправдывали бы себя, если бы ген действительно был наименьшей неделимой структурой хромосомы, функционирующей и мутирующей как единое целое. Однако с расширением возможности генетического анализа было установлено, что классические тесты на аллелизм не всегда дают однозначный результат. На основании этого некоторые ученые пришли к выводу, что представления о гене в свете хромосомной теории несколько упрощены и что необходима более детальнаяÏолесÃÓрасшифровка его функциональной и структурной сущности.

3. Центровая теория гена

Импульсом к дальнейшему развитию теории гена послужили противоречия, наблюдаемые при последовательном строгом применении критериев аллелизма в экспериментах школы А.С. Серебровского с дрозофилой в 20-30 гг.

А.С. Серебровский и его молодые отрудники доказали протяженность и сложную структуру гена в работах по и ледованию так назывемого ступенчатого аллеломорфизма. Явл ние это было открыто при изучении локуса scас (scuteachaete), который контролирует развитие щетинок у D. melanogaster. Его мутации приводят к р дукции щетинок, а также к некоторым дополнительным фенотипич ским эфф ктам. Разные мутантные аллели приводят к различающимся изм н ниям ф нотипа.

Оказал сь, что независимо возникшие мутации в локусе sc-ас, полученные п д действием У- учей, вступают в сложные отношения аллелизма. Две а е и м гут иметь как сходство, так и различия в фенотипическ м пр явлении: в редукции определенных щетинок. При объединении независимо в зникших мутантных аллелей в компаунде обычно редуцировались лишь те щетинки, которые были утрачены у обоих родителей. При графическом изображении взаимодействия нескольких пар аллеломорфов в компаундах получалось нечто вроде лестницы, ступенями которой служили отдельные аллели. Это явлени и получило наименование ступенчатого аллеломорфизма.

На основе исследования ступенчатого аллеломорфизма удалось построить линейный план гена sc-ас. Кроме того, Н.П. Дубининым был сделан вывод о том, что ген sc–ас состоит из более мелких элементов – центров. Предполагалось, что в случае мутирования изменяется не весь ген, а лишь некоторые его центры.

Так, с помощью генетического анализа мутаций scute путем использования классических тестов на аллелизм Серебровский с сотрудниками получили результаты, позволившие им выдвинуть гипотезу о

Генетика с основами биометрии

существовании функциональных единиц меньшего, чем ген, порядка – трансгенов. Они предполагали, что трансгены располагаются внутри гена в линейном порядке и что развитие признака обусловливается их функциональным взаимодействием. В результате была сформулирована так называемая центровая теория гена, согласно которой основной ген (Серебровский предложил называть его базигеном) подразделяется на несколько функционально самостоятельных субгенов (трансгенов).

4. Псевдоаллелизм

С начала 40-х гг. нашего века начали публиковаться работы по проблеме так называемогоÏолесÃÓ«псевдоаллелизма». В них развиваются представления о сложной структуре гена. В работах К. Оливера, М. Грина, Е. Льюиса с D. melanogaster были получены примеры рекомбинаций мутаций, которые в соответствии с функциональным тестом должны были считаться аллельными. Это противоречие между рекомбинационным и функциональным критериями аллелизма и породило термин «псевдоаллелизм».

Открытие Серебровского получило подтверждение спустя почти 20 лет, после того как выяснилось, что ген может быть разделен путем кроссинговера. Эти сведения были получены в 40-х гг. американ кими учеными К. Грином, М. Грином, К. Оливером и Е. Льюи ом при изучении рецессивных мутантных аллелей гена lozenge.

Изучая у дрозофилы д йствие двух алл лей гена lozenge, К. Грин и М. Грин установили, что мутации lz50 и lz8 в гомозиготе и в компаунде (гетероаллельная комбинация) с другими мутациями lz дают ярко выраженный мутантный фен тип, а в компаунде lz50e / lz8 – частично комплементарны и дают фен тип, б изкий к нормальному.

Оливер бнаружил также, что в потомстве, получаемом от анализирующего скрещивания гетерозиготы lz s/ lzg, с постоянной частотой возникают реверсии (в зврат) к дикому типу, которые, по его мнению, можно объяснить рекомбинацией между сцепленными с локусом lozenge аллелями. Аналогичный эффект получил и Льюис при рекомбинационном анализе, произведенном с двумя аллелями другого гена, также определяющего развитие глаз у дрозофилы. Предположив, что отдельные участки гена способны к рекомбинации, Льюис сделал следующее допущение: мутация захватывает не весь ген, а лишь небольшую его часть, между частями гена происходит кроссинговер. Мутации одного гена, т. . аллельные мутации, между которыми происходит кроссинговер, получили название псевдоаллели. В тех случаях, когда наблюдаются противоречия между функциональной и рекомбинационной оценками мутации на аллелизм, используется термин «псевдоаллелизм».

Число примеров «псевдоаллелизма» (рекомбинации между мутациями, аллельными на основании функционального теста) быстро возрастало,