Volkova EM Kaspirovich DA Genetika s osnovami biometrii EUMK

Генетика с основами биометрии

После чего была определена частота появления кроссоверного потомства: 107+107=214 и рассчитана частота кроссинговера между генами y и w: 214/21736=0,010. На основе этих данных была построена первая генетическая карта. Так как частота кроссинговера между генами y и w была

наименьшей и равнялась 0,01, следовательно, эти гены необходимо расположитьÏолесÃÓна расстоянии 1 сМ; если частота кроссинговера между

следующими парами генов w и v равна 0,297, а между y и v – 0,307, следовательно, ген w и v должны располагаться на расстоянии 29,7 сМ, а y и v на расстоянии 30,7 см в следующей последовательности y – w – v.

Изучив расстояние между генами, А. Стертевант сделал вывод: гены на хромосоме располагаются в линейной по ледовательности. Чтобы отобразить расстояние между генами на генетиче кой карте А. Ст ртевант пользовался

«правилом аддитивности генетиче ких ра тояний между генами».

Для составления г н тич ких карт необходимо выявление многих

мутантных генов и провед ние огромного чи ла крещиваний, что возможно

только в результате многол тн й работы многих коллективов генетиков. Наиболее подробные ген тич ские карты составлены для дрозофилы, у которой изучено бо ее 500 мутантных г нов, а также для кукурузы, имеющей в 10 группах сцеп ения свыше 400 генов.

На генетических картах хромосом дрозофилы и кукурузы расстояние многих ген в т ну ев й т чки определено величиной 70 и более единиц. У дрозофилы, например, во вт р й хромосоме ген ballon расположен от нее на расстоянии 107,5 единицы, а у кукурузы расстояние некоторых генов от нулевой точки превышает даже 150 единиц. Между тем частота кроссинговера между двумя генами не может быть больше 50%, так как перекрещивающиеся сестринские хроматиды и гаметы, образуемые дигетерозиготой. При этой величине кроссинговера генетически обнаруживаются как следствие независимого наследования при отсутствии сцепления. Такое несоответствие объясняется тем, что при нанесении гена на карту хромосомы частоту кроссинговера определяют на сравнительно коротких участках, последовательно взятых по длине хромосомы. Общая же длина хромосомы на карте устанавливается путем сложения процента перекреста между соседними генами. В связи с этим общая длина хромосомы на генетической карте может

значительно превышать величину 50 единиц.

При рассмотрении генетических карт обращает на себя внимание неравномерное распределение генов по длине хромосомы. На одних участках гены располагаются чаще, чем на других, а некоторые участки хромосом

Генетика с основами биометрии

вообще генетически неактивны.

Одним из основных методов построения генетических карт является трехфакторное скрещивание, которое позволяет определить:

1.Принадлежность изучаемых генов к группе сцепления (одной или разным).

2.Относительное расстояние между генами и их взаимное расположение на хромосоме.

Трехфакторное скрещивание – метод генного картирования с использованием варианта трансформации, при котором донор несет два аллея дикого типа и один мутантный, а реципиент – два мутантных и один дикий; при этом частота котрансформации оказывается пропорциональной расстоянию между селектируемым и неселектируемым маркерами.

Это скрещивание, в котором родительские формы различаются по одной паре альтернативных признаков, контролируемых аллеями одного гена:

P: ♀ ABC // abc × ♂ abc // abc

рекомбинатный

(2п-2)

кросс. класс (X)

Для определения расстояния между генами, необходимо определить частоту рекомбинации на участках АВ, ВС и АС (рисунок 9).

Генетика с основами биометрии

Рисунок 9 – Генетическая карта участка a-b-c построенная по результатам трехфакторного скрещивания

Между генами А и В частота рекомбинации определяется как доля кроссоверныхÏолесÃгамет (гамет Ab и aB типа)Ó, возникающих в результате кроссинговера на участке АВ и двойного кроссинговера:

rfAB=

Аналогично определяется расстояние между генами В и С (как доля кроссоверных гамет Вс и bC типа):

rfBC=

Расстояние между крайними г нами А и С определяется как доля кроссоверных гамет А c и a C типа, возникающих в результате одиночных обменов на участках АВ и ВС:

rfAC=

Исходя из правила аддетивности, расстояние между крайними генами А и С, должно равняться сумме Расстояний между генами А – В и В – С:

rfAC=rfAB + rfBC

Однако это правило справедливо только в том случае, когда расстояние между крайними генами не превышает 10-15 смМ.

rfAC=rfAB+rfBC

Если расстояние между крайними генами больше 15 см, то это обусловлено двумя факторами:

1. Множественным кроссинговером, протекающим между крайними генами.

Генетика с основами биометрии

2. Низкой разрешающей способностью классического гибридологического анализа.

rfAC=

Истинное расстояние между генами А и С равно сумме частот rfAB и rfBC или (=) сумме определений по числу образования гамет, возникающих в результате одиночного кроссинговера на участке АС, и удвоенного числа образования двойных кроссоверных гамет. Если же расстояние между

положительнойÏолесÃÓинтерфер нции – явл ния, при котором кроссинговер, происходящий на одном участке, пр пятству т одновременному прохождению кроссинговера на соседнем участке. Знач ние интерференции определяется по формуле:

крайними генами составляет менее 15 сМ, то в анализирующем скрещивании реально не обнаруживается класса двойных кроссоверных гамет.

4. Понятие об интерференции и коинциденции

Практический (или наблюдаемый) двойной кроссинговер можно

I=1 C,

где: С – к эффициент к инциденции (или коэффициент совпадения).

По мере уменьшения двух расстояний, разделяющих три гена, интерференция увеличивается. Величина интерференции измеряется с помощью коэффициента коинциденции т. . совпадения. Содержание понятия «коинциденция» противоположно содержанию понятия «интерференция». Коэффициент коинциденции определяется как частное от деления фактически полученной величины двойных кроссоверов на их ожидаемое число.

С=

Например, если частота кроссинговера между генами Y и W – 1,5%, между W и M 32,5%, а частота двойных кроссинговеров равна 0,04%, то коэффициент коинциденции будет составлять:

Генетика с основами биометрии

С= =0,00353

Коэффициент коинциденции (С) – отношение наблюдаемого числа кроссинговера (двойного перекреста) к теоретически ожидаемому, измеряется в долях или процентах.

С=0 – интерференции нет, фактическая и ожидаемая частоты совпали (нет влияния одного кроссинговера на другой).

C>1 – интерференция отрицательная и один кроссинговер стимулирует другой.

C<1ÏолесÃÓ– интерференция положительная и один кроссинговер тормозит другой.

У дрозофилы на коротких участках хромосом, которые равны или меньше 10 единиц кроссинговера, двойные кроссоверы вообще не происходят. На участках, отстоящих друг от друга более чем на 40 единиц перекреста, двойные перекресты происходят уже по правилам свободных сочетаний друг с другом. Здесь С = 1, ибо имеет я полное овпадение фактического числа двойных кроссоверов их ожидаемым чи лом.

Причины интерференции неизве тны. Считалось, что это связано с упругостью хромосом. Сейчас выд ляют другую причину – конкуренцию за фермент.

Микроорганизмы, используемые в качестве модельных генетических объектов, отличаются относительной простотой их организации. Большинство используемых в генетических экспериментах микроорганизмов являются одноклеточными. Структурная организация вирусов и фагов еще проще – лишены клеточной организации. Про тота организации как-бы сокращает путь от гена до проявления, контролируемого этим геном признака. Таким образом, фенотипическое проявление многих генов оказалось возможным изучать на биохимическом уровне по проявлению активности отдельных ферментов.

Микроорганизмы быстро размножаются и их легко культивировать в лабораторных условиях на искусств нных питательных средах. На плотной питательной среде можно по учить от одной исходной клетки колонию генотипически дн р дных к еток, а затем размножить их до большого количества, что не бх димо д я биохимического и молекулярного анализа. У микроорганизм в д стат чно егко получать самые разнообразные мутации. Гаплоидность мн гих микроорганизмов обеспечивает проявление рецессивных мутаций, к т рые у диплоидных организмов могут быть «замаскированы» присутствием нормальной аллели.

В генетических экспериментах на микроорганизмах широко используются ауксотрофные мутации. Клетки большинства микроорганизмов способны синтезировать необходимые им для нормальной жизнедеятельности аминокислоты, азотистые основания, витамины из неорганических соединений в присутствии источника энергии (чаще всего глюкозы). Такие клетки называют прототрофными, или клетками дикого типа. Штаммы дикого типа можно выращивать на минимальной питательной среде с относительно простым составом. Такая среда содержит набор неорганических соединений в определенной комбинации и источник энергии в виде углевода. Клетка, утратившая в результате мутации способность к биосинтезу того или иного соединения, называется ауксотрофной.

Клетки ауксотрофных штаммов, в отличие от клеток дикого типа, не

Генетика с основами биометрии

способны расти на минимальной питательной среде. Однако если в минимальную среду добавить вещество, синтез которого утрачен в результате мутации, способность мутантных клеток к росту восстанавливается. Минимальная среда с необходимыми для роста ауксотрофов питательными добавками получила название селективной среды. Селективные среды позволяют отбирать определенный класс мутантов.

Значительно ускоряет работу по генетической идентификации отдельных колоний метод «отпечатков» колоний, предложенный Д. Ледербергом. С помощью этого метода можно за один прием переносить на чашки Петри с разными селективными средами до сотни отдельных колоний. На рисункеÏолесÃÓ1 изображено приспособление для переноса отпечатков колоний, иллюстрирующее сущность этого метода.

Рисун к 1 – Бархатный штамп для снятия отпечатков колоний с чашек Петри: 1– агариз ванная среда с исходными колониями на поверхности; 2 – бархат; 3 –

чашка Петри; 4 – ободок; 5 – цилиндр

Селективные среды с успехом применяются при проведении генетического анализа. Они позволяют полностью исключить рост родительских штаммов и отбирать только рекомбинантные клетки, даже если рекомбинация между маркерами происходит низкой частотой. Использование селективных сред позволяет выделить одну рекомбинантную клетку среди 107–108 родительских клеток. Высокая чувствительность этого метода позволила повысить разрешающую способность генетического анализа и проводить тонкое генетическое картирование, т.е. определять местоположение мутантных сайтов внутри гена.

Генетика с основами биометрии

2. Организация генетического аппарата у бактерий и вирусов

Организация генетического аппарата у бактерий. Генетический аппарат бактерий представлен бактериальной хромосомой, внехромосомными факторами наследственности – плазмидами, а также входящими в их состав мобильными генетическими элементами (рисунок 2).

Генетический аппарат бактерий

би деградации

Рисун к 2 – Устройство генетического аппарата бактерий

Жизненно важная генетическая информация бактерий сосредоточена в цитоплазме в единственной хромосоме, что позволяет отнести бактерии к гаплоидным организмам. Возможны некоторые исключения, например, Vibrio cholerae содержит две кольцевидные хромосомы.

ДНК в хромосоме суперспирализована. Е размер в раскрученном состоянии может достигать 1 мм. ДНК состоит из двух комплементарных друг другу цепочек: напротив, аденина находится тимин, а напротив гуанина – цитозин. Цепи антипараллельны и располагаются во взаимно противоположных направлениях: одна в ориентации 5' 3', другая – 3' 5'. На 5' конце ДНК находится фосфатная группа, прикрепленная к 5-ому углеродному атому дезоксирибозы. 3' конец оканчивается ОН-группой, присоединяющейся к 3-ему углеродному атому дезоксирибозы.

Генетика с основами биометрии

В геноме разных видов бактерий содержание нуклеотидов варьирует от 5,8×105 до 13×106 п.о., что соответствует приблизительно 103 генов (1 ген на 1000 п.о.) (таблица 1). Это в 100 раз больше, чем у вирусов, и в 1000 раз меньше, чем в среднем у эукариот.

Таблица 1 – Размер геномов медицински значимых микроорганизмов

Генетика с основами биометрии

Несмотря на весьма значительную разницу в сложности организации фенотипа прокариот и эукариотических организмов, различие в количестве генов не велико. Многоклеточные организмы, чей геном всего лишь в 5-10 раз больше

микроорганизмов, имеют более сложные регуляторные системы, которые могут контролировать одновременную экспрессию большого числа различных групп генов. Как правило, микроорганизмы, обитающие во внешней среде, имеют больший размер генома, чем патогены человека и животных, что связано с адаптацией патогенов к одной экологической нише – организму человека. Расшифровка последовательности нуклеотидов в геноме большинства патогенов

позволяет использовать первичную труктуру ДНК для оценки родства различных

видов микроорганизмов. Как правило, бактерии одного рода и семейства проявляют сходство 70-80% генетиче кой информации, и только 20-30% объема генома приходится на уникальную для вида или варианта генетическую информацию.

подразделяются на:

Структурные гены детерминируют первичную структуру белков бактерий и м гут быть классифицированы на две большие группы:

ÏолесÃÓтруктурные;  функци на ьные.

1. Гены «д машнего х зяйства»:

а) Гены, отвечающие за биохимческие процессы в клетке (метаболизм аминокислот, углеводов, энергии, липидов, кофакторов и витаминов, сложных углеводов и липидов, нуклеотидов);

б) Гены, отвечающие за биологические процессы клетки (подвижность клеток, обработку информации из внешней среды, транспорт веществ через мембраны, сигнальную трансдукцию, обработку генетической информации,

репликацию и репарацию, развитие и деградацию, транскрипцию, трансляцию).