Волкова_С_А_,_Боровков_Н_Н_Основы_клинической_гематологии

Глава 2. Методы исследования клеток крови, органов кроветворения и системы гемостаза

ким характером ряда хромосомных аномалий. Специфический характер цитогенетических аномалий означает преимущественное или абсолютное сочетание аномалии с определенным иммунофенотипом опухолевых клеток. Например: t(9;22) — абсолютный критерий хронического миелолейкоза, t(15;17) — острого промиелоцитарного лейкоза. На сегодняшний день наиболее достоверное прогностическое значение в отношении курабельности (излечимости) острого лейкоза имеют именно цитогенетические аномалии, лежащие в основе острого лейкоза

иотносящиеся к аномалиям благоприятного, промежуточного

инеблагоприятного прогноза.

Стандартная цитогенетика в метафазных пластинках также имеет большое диагностическое значение для оценки полного цитогенетического ответа (цитогенетической ремиссии) заболевания на лечение, свидетельствующего, в частности, для ХМЛ об объеме лейкемических клеток в организме в пределах 109.

В последние годы было показано, что при некоторых лейкозах генетические изменения могут не сопровождаться видимыми количественными или качественными изменениями хромосом, т.е. носить эпигеномный или эпигенетический характер (не связаны непосредственно с повреждением структуры генов). Такие генетические изменения можно обнаружить только с помощью молекулярно-биологических методов.

2.4. Молекулярно-биологические методы исследования

Развитие и использование молекулярно-биологических методов исследования (МБИ) в практической гематологии явилось логичным итогом изучения патогенеза опухолей кроветворной ткани. Закономерным результатом хромосомной аномалии является образование онкогена, а следствием его деятельности — синтез онкопротеина, непосредственно реализующего механизм онкогенеза на уровне биохимических, а точнее, молекулярно-биологических процессов жизнедеятельности клетки.

71

Часть 1. Введение в клиническую гематологию

Обнаружение онкогена, онкопротеина в популяции клеток костного мозга или периферической крови имеет важное диагностическое значение. Использование МБИ на этапе первичной диагностики опухолевого заболевания позволяет определять специфические мутации генов в случаях минимальных клинических проявлений посредством исследования периферической крови, не подвергая пациента пункции костного мозга. Прежде всего, это касается случаев диагностики хронических миелопролиферативных заболеваний на ранних стадиях развития, манифестирующих нейтрофильным лейкоцитозом с небольшим левым сдвигом (появлением молодых форм нейтрофилов в периферической крови), тромбоцитозом. Отличием от реактивных изменений в этих случаях становится обнаружение онкогена BRCABL1, специфичного для хронического миелолейкоза Ph-позитивного, или онкогена JAK-2, специфичного для семейства Ph-негативных миелопролиферативных неоплазий (первичного миелофиброза, истинной полицитемии и эссенциальной тромбоцитемии).

Быстрое получение результата МБИ по сравнению с цитогенетикой в метафазных пластинках крайне важно и при диагностике острых лейкозов, когда с позиции морфологических методов исследования диагноз сомнений не вызывает, но выявление специфической цитогенетической аномалии определяет характер химиотерапии. В частности, речь идет об остром промиелоцитарном лейкозе и онкогене PMLRARA, наличие которого служит основанием для использования лекарственного препарата трансретиноевой кислоты (весанойда), коренным образом меняющего прогноз заболевания.

Наибольшее значение МБИ в диагностике онкогематологических заболеваний связано с возможностью детекции таких количеств опухолевых клеток в организме, которые не могут быть выявлены ни морфологическими, ни цитогенетическими методами, а именно — в диагностике минимальной остаточной болезни или молекулярного рецидива опухоли. МБИ — основа мониторинга пациентов после достижения гематологической, цитогенетической ремиссии заболевания.

В число методов МБИ на сегодняшний день входят 4 основные разновидности:

72

Глава 2. Методы исследования клеток крови, органов кроветворения и системы гемостаза

•блоттинг РНК (гибридизация) — нозерн-блоттинг;

•блоттинг ДНК (гибридизация) — саузерн-блоттинг;

•FISH-гибридизация;

•полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Первые две методики не получили широкого распространения в практике клинической гематологии.

F I S H - г и б р и д и з а ц и я — флюоресценция в месте гибридизации хромосом. Метод позволяет идентифицировать с помощью флюоресцирующих молекул хромосомные аберрации

вядрах клеток, находящихся вне митотического цикла, т.е. в неделящихся клетках.

Данный метод является своего рода мостиком от цитогенетического исследования к молекулярно-биологическому. Идентификация (метка) определенного участка ДНК в геноме клетки осуществляется посредством его гибридизации со специальной комплементарной, меченной флюоресцентным веществом, последовательностью ДНК, называемой зондом. Флюоресцентные зонды имеют различные цвета. Зондами желтого и синего цвета метят участки ДНК хромосом 9 и 21. Появление зеленого «сливного» цвета свидетельствует о наличии онкогена BCRABL1 (продукта слияния участков этих хромосом).

FISH-гибридизация может применяться для различных целей с использованием зондов трех типов:

•локус-специфичные зонды, связывающиеся с определенными участками хромосом — используются для идентификации короткой последовательности выделенной ДНК, которая считается известным онкогеном;

•альфоидные, или центромерные, зонды-повторы представляют собой повторяющиеся последовательности центромерных областей хромосом — с их помощью каждая хромосома может быть окрашена в различный цвет, что позволяет быстро определить число хромосом и отклонения их от нормального числа;

•зонды на всю хромосому являются набором небольших зондов, комплементарных к отдельным участкам хромосомы, но

вцелом покрывающих всю ее длину — позволяют «раскрасить» всю хромосому и получить дифференциальный спектральный кариотип индивида. Данный тип анализа применяется для оцен-

73

Часть 1. Введение в клиническую гематологию

ки хромосомных аберраций, например транслокаций, когда кусочек одной хромосомы переносится на плечо другой.

FISH-гибридизацию применяют для изучения клеток периферической крови, костного мозга, биоптатов опухоли, плаценты, эмбриональных тканей, амниотической жидкости без предварительной их фиксации для выявления количественных и качественных хромосомных аберраций. Меченные флюоресцентными метками специфические ДНК-зонды гибридизуются с хромосомной ДНК как на метафазных, так и в интерфазных препаратах. Одновременно можно использовать множественные зонды к разным локусам ДНК.

FISH-гибридизация является чувствительным методом для идентификации хромосомных аберраций при количествах лейкозных клеток менее 109, обеспечивая при этом быстрый анализ большого (>500) числа клеток. Метод обладает высокой точностью для идентификации неизвестных фрагментов хромосомной ДНК.

П о л и м е р а з н а я ц е п н а я р е а к ц и я — это метод, который позволяет синтезировать определенные фрагменты ДНК из огромного количества геномной ДНК, содержащейся в клетке. В основе метода лежит репликация, или достраивание второй цепи ДНК.

Сначала в фазу «тепловой денатурации» при температуре 95°С происходит разрушение связей между двумя цепочками ДНК. Далее к одноцепочечной ДНК прикрепляются так называемые праймеры — «затравка» для достраивания второй цепи (фаза «отжига»). Праймеры — это короткие одноцепочечные фрагменты ДНК, или олигонуклеотиды, которые по принципу комплементарности присоединяются к участкам, ограничивающим нужные для поиска районы ДНК. На следующем этапе начинает действовать фермент ДНК-полимераза, катализирующий достраивание второй цепи к участку ДНК между праймерами из дезоксинуклеотидтрифосфатов, находящихся в реакционной смеси (фаза «синтеза»).

Циклы из трех перечисленных фаз повторяются многократно — до 30 раз. Амплификатор при наличии соответствующих праймеров размножает (амплифицирует) строго определенный

74

Глава 2. Методы исследования клеток крови, органов кроветворения и системы гемостаза

участок ДНК за 2–3 ч с получением ПЦР-продукта в количестве, которое можно выявить методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле.

Существуют разновидности метода ПЦР, такие как обратная транскриптазная реакция, гнездная ПЦР (nested PCR) и ПЦР в реальном времени (PCR-real time).

ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) позволяет количественно оценить число исходных копий ДНК в образце, что невозможно при проведении обычной ПЦР (качественно определяющей наличие искомого транскрипта).

При первичной диагностике с помощью метода ПЦР можно выявить последовательности ДНК, являющиеся специфическими генетическими аномалиями опухолей гемопоэтической и лимфоидной ткани. Более того, именно этот метод (особенно ПЦР-РВ) наиболее доступен для контроля за наличием и динамикой патологического клона во время лечения, что позволило обосновать понятие «минимальной остаточной болезни» (МОБ).

Наиболее информативной моделью для иллюстрации роли МБИ в контроле за объемом клона опухолевых клеток в организме является модель ХМЛ при лечении ингибитором тирозинкиназы 1-й генерации — иматинибом (гливеком) (рис. 2.2). На момент установления диагноза при максимальном уровне лейкемических клеток 1012 уровень BCR-ABL1 транскрипта, определяемого методом ПЦР-РВ, составляет 100%. Полный гематологический ответ (ПГО) — нормальный анализ крови, отсутствие сплено-, гепатомегалии — сопровождается 100-крат- ным уменьшением популяции лейкемических клеток до 1010 и уровня транскрипта BCR-ABL1 до 1%. Полный цитогенетический ответ (ПЦО) — 0% Ph-позитивных клеток по данным стандартной цитогенетики или FISH-гибридизации — соответствует 1000-кратному снижению объема опухолевых клеток (до 109) и уровня транскрипта BCR-ABL1 до 0,1%. Большой молекулярный ответ (БМО) характеризуется уровнем транскрипта ниже 0,1 до 0,01%. Количество лейкемических клеток ниже 106 и уровень транскрипта ниже 0,001% относятся к категории полного молекулярного ответа (ПМО).

75

Рис. 2.2. Соотношение между уровнем ответа на терапию, количеством лейкемических клеток и уровнем BCR-ABL1 транскрипта

2.5. Методы исследования гемостаза

Существует несколько подходов к лабораторному обследованию системы гемостаза. Первый из них предполагает выбор лабораторных тестов на основании алгоритма дифференциальной диагностики геморрагического синдрома. Второй путь — исследование коагулограммы как интегрального теста, включающего, как правило, фиксированный набор лабораторных исследований различных звеньев системы гемостаза. Получение коагулограммы с заданным количеством лабораторных тестов имеет свои преимущества и недостатки. Преимуществом является возможность комплексной, одномоментной оценки всех звеньев гемостаза, противосвертывающей системы, системы фибринолиза и тестов на ДВСсиндром. Недостаток заключается в трудоемкости, высокой стоимости исследования с получением зачастую излишней информации.

76

Глава 2. Методы исследования клеток крови, органов кроветворения и системы гемостаза

При лабораторных исследованиях гемостаза следует:

1)забирать кровь с минимальным использованием жгута, недопустимо взятие крови шприцем или из подключичного катетера;

2)соблюдать этапность: первый этап — скрининговые тесты, второй — пробы, позволяющие уточнить диагноз;

3)проводить повторное обследование для подтверждения результата в случае выявления серьезных нарушений в системе гемостаза;

4)интерпретировать результаты с учетом возможного влияния принимаемых лекарственных средств и других воздействий.

При исследованиях системы гемостаза предпочтительно использование производительных и высокоточных (по сравнению с мануальными определениями) коагулометров

иагрегометров, а также стандартизированных расходных материалов.

2.5.1. Исследование сосудисто- тромбоцитарного гемостаза

В р е м я к р о в о т е ч е н и я. Это время от момента нанесения стандартной раны кожи до момента прекращения вытекания крови. Оно фиксируется посредством промокания раны фильтровальной бумагой или калориметрически по цвету жидкости, куда поступает вытекающая из пальца кровь. В норме время кровотечения составляет 3–10 мин.

Оно характеризует функциональную активность тромбоцитов и взаимодействие тромбоцитов с сосудистой стенкой, но не выявляет всех тромбоцитарных нарушений. Этот скрининговый тест позволяет заподозрить тромбоцитопатии различного генеза, болезнь Виллебранда и нарушения проагрегантных свойств сосудистой стенки. Метод мало поддается стандартизации и подвержен большому влиянию внешних факторов (глубина прокола кожи, температура конечности, уровень артериального давления). Не должен использоваться для предоперационного планового скрининга.

П о д с ч е т к о л и ч е с т в а т р о м б о ц и т о в произво-

77

Часть 1. Введение в клиническую гематологию

дится с помощью гематологического анализатора или в мазке периферической крови.

И с с л е д о в а н и е а г р е г а ц и и т р о м б о ц и т о в как оценка их функциональной активности. Для исследования используют физиологические индукторы агрегации тромбоцитов: тромбин, адреналин, АДФ, коллаген; или специальные индукторы, такие как ристомицин.

Наиболее часто изучают АДФ-, адреналин-, коллаген- и ристомицин-индуцированную агрегацию тромбоцитов с графической регистрацией процесса на агрегометре. Основными параметрами агрегатограммы являются степень агрегации (в процентах) и время агрегации (в минутах). Повышение агрегационной активности тромбоцитов характерно для претромботических состояний, тромбозов, атеросклероза, васкулитов, возможно при беременности. Снижение агрегационной активности тромбоцитов наблюдают при первичных и симптоматических тромбоцитопатиях, при лечении антиагрегантами.

2.5.2.Исследование коагуляционного (плазменного) гемостаза

А к т и в и р о в а н н о е ч а с т и ч н о е т р о м б о п л а с - т и н о в о е в р е м я (АЧТВ). Термин «частичный тромбопластин» означает, что реактив содержит только фосфолипиды, в нем нет тканевого фактора. Метод используется как тест для оценки внутреннего механизма свертывания крови, прежде всего скрининга на дефицит факторов VIII или IX (гемофилия А и В), волчаночного антикоагулянта и слежения за антикоагулянтным действием гепаринов. Каждая лаборатория определяет свой нормальный диапазон АЧТВ с учетом используемых реактивов.

Укорочение АЧТВ (активация внутреннего механизма свертывания) обнаруживают при тромбозах, тромбоэмболиях, ДВСсиндроме (гиперкоагуляционная фаза), иногда при нормально протекающей беременности.

Удлинение АЧТВ имеет место при большом спектре патологических состояний. Прежде всего это дефицит факторов внутреннего пути свертывания: VIII (гемофилия А), IX (гемо-

78

Глава 2. Методы исследования клеток крови, органов кроветворения и системы гемостаза

филия В), XI, XII при нормальных результатах протромбинового теста; дефицит факторов II, V, X в случае сопутствующей гипокоагуляции в протромбиновом тесте; дефицит фактора Виллебранда, терапия обычным, нефракционированным гепарином, лечение антикоагулянтами непрямого действия, ДВС-синдром (потребление факторов свертывания в фазу гипокоагуляции), переливания реополиглюкина, препаратов гидроксиэтилкрахмала (инфукол, валекам, НЕS), наличие волчаночного антикоагулянта, мутация фактора IX, дефекты при получении крови для исследования (гемолиз, передозировка цитрата натрия, забор крови из гепаринизированного катетера).

П р о т р о м б и н о в о е в р е м я (по Квику), МНО. Протромбиновое время (ПТВ) — тест для оценки внешнего механизма свертывания крови. ПТВ обычно используется для определения активности фактора VII, контроля за лечением непрямыми антикоагулянтами, при скрининге системы гемостаза, а также для количественной оценки фибриногена в автоматических коагулометрах. Каждая лаборатория определяет свой нормальный диапазон ПТВ с учетом используемых реактивов.

Укорочение ПТВ свидетельствует об активации внешнего механизма свертывания — при ДВС-синдроме, в последние недели беременности, при приеме пероральных контрацептивов, лечении концентратами факторов протромбинового комплекса (Фейба), НовоСевен и др.

Удлинение ПТВ имеет место при дефиците или аномалии факторов протромбинового комплекса (VII, X, V, II), в случаях приема антикоагулянтов непрямого действия (варфарин), при болезнях печени и желчевыводящей системы, лечении нефракционированным гепарином (тест реагирует лишь на сравнительно высокие концентрации антикоагулянта, примерно от 0,5 МЕ/мл крови и выше), ДВС-синдроме (потребление факторов свертывания в переходную фазу и фазу гипокоагуляции), на фоне переливаний реополиглюкина, препаратов гидроксиэтилкрахмала (инфукол, валекам), при наличии в крови волчаночного антикоагулянта (возможно), дефектах взятия крови для исследования (гемолиз, передозировка цитрата натрия, забор крови из гепаринизированного катетера).

79

Часть 1. Введение в клиническую гематологию

МНО (Международное нормализованное отношение), латинская аббревиатура — INR (International Normalized Ratio) — дополнительный способ представления результатов протромбинового теста. Рекомендован комитетом экспертов ВОЗ и другими международными организациями по стандартизации в гематологии для контроля терапии непрямыми антикоагулянтами.

МНО — это отношение ПТВ пациента к ПТВ нормальной плазмы в степени международного индекса чувствительности (МИЧ). МИЧ — коррекционный фактор, специфичный для каждой партии реактивов, рассчитанный на основании стандартов ВОЗ для тромбопластина.

МНО — математическая коррекция, при помощи которой производится стандартизация ПТВ, что позволяет сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях. МНО и протромбин по Квику коррелируют отрицательно: снижение протромбина по Квику соответствует повышению МНО.

Внорме МНО приближается к 1. Терапевтический диапазон МНО 2–3 на фоне терапии непрямыми антикоагулянтами обеспечивает профилактику тромбоза без увеличения риска кровотечения.

Внастоящее время все большое распространение получает способ измерения МНО в амбулаторных условиях (на дому самим пациентом) с помощью так называемых экспресс-ко- агулометров: «Коагучек Экс Эс» / «CoaguChek XS», «Коагучек Экс Эс Плюс» / «CoaguChek XS Plus» и «Ин Рацио 2» / «INRatio2».

Тр о м б и н о в о е в р е м я (ТВ) — третий по значимости базисный коагуляционный тест. Характеризует конечный этап процесса свертывания — превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина. На него влияет концентрация фибриногена в плазме и наличие продуктов деградации фибрина. Референсные значения ТВ: 18–24 с.

Укорочение ТВ характерно для гиперфибриногенемии (фибриноген 6,0 г/л и выше), начальной (гиперкоагуляционной) фазы острого и подострого ДВС-синдрома.

Удлинение ТВ имеет место при гепаринотерапии обычным гепарином (тест реагирует на сравнительно низкие концентра-

80