Окраска по Граму
Предложен в 1884 году датским врачом Г. К. Грамом. Ганс Кристиан Йоахим- Грам (дат. Hans Christian Joachim Gram; 13 сентября 1853 - 14 ноября 1938)- датский бактериолог. Грам изучал ботанику в Университете Копенгагена и был ассистентом ботаники у зоолога Япетуса Стенструпа.
Он поступил в медицинскую школу в 1878 году и закончил её в 1883. Меж- ду 1878 и 1885 годами Грам путешествовал по Европе. В Берлине, в 1884, он раз- работал метод разделения двух основных классов бактерий. Метод окраски Грама продолжает оставаться стандартной процедурой в медицинской и ветеринарной микробиологии.
В 1891 году Грам начал читать лекции по фармакологии, и позже в том же году был назначен профессором в Университете Копенгагена. В 1900 он стал профессо- ром медицины.
Работой, которая принесла ему мировую известность, стала разработка метода окраски бактерий. Метод впоследствии играл главную роль в классификации бак- терий. Грам в своей первой публикации отметил: «И таким образом я публикую метод, несмотря на то, что знаю, что сейчас он имеет недостатки и несовершенен; но я также надеюсь, что в руках других исследователей он превратится во что-то полезное».
При окраске по этому методу все бактерии подразделяются на грамположи- тельные и грамотрицательные, что облегчает проведение дифференциальной ди- агностики инфекционных заболеваний и выбор средств антимикробной терапии.
Окраска состоит из следующих этапов:
На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропи- танную раствором генцианвиолета, капают 2 капли воды и оставляют на 2-3 мин.
Фильтровальную бумагу убирают, раствор сливают, добавляют раствор Люголя на 1-2 мин., сливают. Водой не промывают!
На 15-30 сек. Наносят на мазок 96 % спирт для обесцвечивания мазка, и немедленно промывают препарат водой!
На мазок наносят фуксин Пфейффера на 1-2 мин., смывают, препарат про- мывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под им- мерсией.
Сущность метода окраски по Граму состоит в том, что отношение к крас- кам зависит от химического состава и структурных особенностей клеточной стен- ки микробной клетки, в частности наличия муреина (пептидогликана) и частично
липидов. Грамположительные бактерии прочно удерживают комплекс краски генцианвиолета с йодом (раствор Люголя). Обработка бактерий спиртом вызывает разбухание муреина и уменьшает диаметр пор клеточной стенки, в результате кра- ситель оказывается как бы«запертым»и воздействие второго красителя не дает видимых результатов. Поэтому грамположительные микроорганизмы, имеющие большое содержание муреина (до 80 %, трехслойная оболочка, наличие тейхоевых кислот), окрашиваются в фиолетовый цвет.
У
грамотрицательных микроорганизмов
слой муреина тоньше (10-20 %, од- нослойная
оболочка, нет тейхоевых кислот), поры
до конца не смыкаются и спирт свободно
проникает сквозь клеточную стенку и
обесцвечивает бактерию. Они со- держат
большое количество липидов, которые
хорошо растворяются в спирте и способствуют
обесцвечиванию микробных клеток, поэтому
они окрашиваются в красный цвет (рисунки
16, 17, 18).
Рисунок 16 - Этапы окраски мазка по Граму.
Рисунок 17 - Этапы окраски мазка по Граму.
Рисунок 18 - Этапы окраски мазка по Граму.